一种具有抗衰老作用的外泌体-超氧化物歧化酶纳米制剂及其制备方法技术

一种具有抗衰老作用的外泌体‑超氧化物歧化酶(SOD)纳米制剂及其制备方法，属于生物技术领域。本发明专利技术通过挤出法结合皂苷辅助的策略将SOD酶分子载入到外泌体中，并以制备的SOD@EXO纳米制剂为纳米药物，以N2野生型秀丽隐杆线虫为模式生物，系统评价了该纳米制剂在抗衰老方面的作用效果与机制。本发明专利技术将SOD装载进入外泌体，不仅保留了天然酶的催化活性，同时较天然SOD具有更加显著的优势，如延长半衰期、降低免疫原性和增加膜通透性等。该纳米制剂具有较高的载药量，同时能够实现稳定的药物释放，最终构建低免疫原性及高催化活力的外泌体‑超氧化物歧化酶纳米制剂，极大提升SOD分子的半衰期和抗衰老治疗效果。

A kind of exosome-superoxide dismutase nano-preparation with anti-aging effect and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
一种具有抗衰老作用的外泌体-超氧化物歧化酶纳米制剂及其制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种具有抗衰老作用的外泌体-超氧化物歧化酶(SOD)纳米制剂及其制备方法。
技术介绍
衰老(senescence)是生物体细胞、器官以及组织的功能随时间而逐渐丧失的渐进过程。现代衰老学说认为，机体的衰老过程与自由基及所诱导的脂质过氧化对细胞和机体的损伤有关。自由基及其衍生物是指具有高度活性的不配对电子的原子团，具有强氧化性，是人体氧化还原反应的重要反应成分。适量的自由基能够促进细胞增殖，刺激吞噬细胞杀灭细菌。但过量的自由基对脂质、DNA等物质产生伤害作用，造成生物膜的损伤，使机体处于不正常的状态，从而加速衰老。超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，EC1.15.1.1)简称SOD，是一种酸性金属酶，广泛存在于动物、植物、微生物体内。根据酶分子中所含金属辅基的不同，超氧化物歧化酶主要可分为Cu/Zn-SOD，Mn-SOD，Fe-SOD等类型，其中Cu/Zn-SOD研究的最多。SOD能催化超氧阴离子自由基O2·-发生歧化反应，在生物体防御氧化损伤的过程中，SOD起到清除和减少人体内过多的自由基、减轻细胞组织过氧化损伤、提高机体免疫力、延缓衰老的作用。此外，人体内的SOD可有效地通过清除超氧阴离子自由基最终能达到抑制癌细胞的效果，Mn-SOD表达效果更为突出。SOD也具有极强的抗炎症作用，有歧化活性氧、消除炎症、保护关节的作用，在类风湿性关节炎患者中，血清中SOD水平显著低于健康人。但是SOD的免疫原性、不稳定性、以及在体内的半衰期较短等缺点，限制了其在临床和保健方面的应用。外泌体(Exosome,EXO)是由多种活细胞分泌的30～150nm的纳米级囊泡，来源于晚期核内体，是由细胞内多泡体(MVBs)出芽形成，再与细胞膜融合后释放到细胞外基质中，几乎所有类型的细胞都能分泌，广泛存在于各种体液中，其功能主要为在细胞间转运相关物质从而实现供受体细胞之间的物质和信息交流。外泌体作为药物的天然内源性载体具有独特优势，如良好的生物相容性、细胞运输药物的效率高和更强的靶部位识别能力等，因此外泌体有望可以成为良好的蛋白质药物递送载体，为相关疾病的治疗提供一个良好的纳米药物平台，具有广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术通过挤出法结合皂苷辅助的策略将SOD酶分子载入到外泌体中，构建了一种外泌体-超氧化物歧化酶纳米制剂(SOD@EXO纳米制剂)，并以制备的SOD@EXO纳米制剂为纳米药物，以N2野生型秀丽隐杆线虫为模式生物，系统评价了该纳米制剂在抗衰老方面的作用效果与机制。本专利技术将SOD装载进入外泌体，不仅保留了天然酶的催化活性，同时较天然SOD具有更加显著的优势，如延长半衰期、降低免疫原性和增加膜通透性等。该纳米制剂具有较高的载药量，同时能够实现稳定的药物释放，能显著抵抗线虫的氧化应激状态，降低线虫体内活性氧水平，提高线虫健康状况，延长线虫寿命。最终构建了低免疫原性及高催化活力的外泌体-超氧化物歧化酶纳米制剂，极大提升SOD分子的半衰期和抗衰老治疗效果。因此，该纳米制剂在清除自由基、延缓衰老方面具有良好的应用前景，成为一类具有良好抗衰老效果的纳米制剂。本专利技术中所涉及的SOD来源于牛血，属于Cu/Zn-SOD，能够清除机体代谢过程中产生的过量超氧阴离子自由基，延缓由于自由基侵害而出现的衰老现象。本专利技术所述的一种外泌体-超氧化物歧化酶纳米制剂的制备方法，其步骤如下：(1)获得外泌体供体细胞的上清液400～600mL，然后在200～400g条件下离心10～20min去除悬浮细胞，再在2000～4000g条件下离心10～20min去除细胞碎片，最后在8000～12000g条件下离心20～40min去除较大的颗粒状物质；(2)将步骤(1)获得的上清液经0.22μm的滤膜过滤，去除大于220nm的颗粒，再将上清液经过100kDa截留分子量的超滤离心管进行浓缩，收集超滤离心管上层浓缩液；(3)将步骤(2)得到的浓缩液在90000～110000g条件下离心1～2h，去除上清液，保留沉淀外泌体；然后用PBS缓冲液重悬此沉淀外泌体，在相同的条件下再次离心，去除上清液，保留沉淀外泌体；最后再以1～2mL的PBS缓冲液重悬此沉淀外泌体，其中外泌体的浓度为1～3mg/mL；(4)将超氧化物歧化酶(SOD)和皂素加入到步骤(3)得到的溶有外泌体的PBS缓冲液中，然后装入基于注射器的脂质体挤出器(AvantiPolarLipids)，挤压通过100nm聚碳酸酯膜20～30次；挤压过程中，外泌体膜被破坏，与超氧化物歧化酶(SOD)剧烈混合；外泌体载药后通过90000～110000g离心除去游离的SOD和皂素，离心产物以PBS缓冲液重悬后得到本专利技术所述的外泌体-超氧化物歧化酶纳米制剂(SOD@EXO)；上述方法中，外泌体供体细胞为人胚肾上皮细胞(HEK293)，外泌体蛋白质量与超氧化物歧化酶(SOD)的质量比为1：0.2～0.8，皂素在PBS缓冲液中的浓度为1～2mg/mL。本专利技术中所采用的挤出法结合皂苷辅助的策略，将SOD担载进入外泌体，相较于游离SOD，具有如下优点：合成条件温和，生物相容性好，对酶活性影响小，装载量高，具有良好的膜通透性，释放时间长的特点。本专利技术所构建的SOD@EXO纳米制剂基于超氧化物歧化酶抗自由基的活性，以N2野生型秀丽隐杆线虫为衰老模型，进行给药，SOD@EXO可以明显提高线虫抵抗外界不良环境的能力，延长线虫的寿命。综上，本专利技术通过挤出法结合皂苷辅助将SOD分子担载进外泌体之中，合成了SOD@EXO纳米制剂。以N2野生型秀丽隐杆线虫为模式生物，证明SOD@EXO纳米制剂能显著抵抗线虫的氧化应激状态，降低线虫体内活性氧水平，提高线虫健康状况，延长线虫寿命。因此，该纳米制剂在清除自由基、延缓衰老方面具有很好的应用前景，在制备治疗抗衰老的药物方面可以得到应用，成为一类具有良好抗衰老效果的纳米制剂。附图说明图1：实施例1合成的EXO、SOD@EXO的透射电镜图。图2：SOD@EXO中外泌体标志蛋白及SOD的鉴定图。图3：游离SOD与SOD@EXO的相对酶活性柱形图。图4：(a)为线虫给药后不同时间的荧光显微镜图，b)为线虫给药后不同时间由ImageJ软件计算得到的荧光数据曲线，线虫摄取时间4h。图5：SOD@EXO对线虫氧化损伤能力的存活率曲线。横坐标为时间，纵坐标为线虫存活率。图6：SOD@EXO抵抗线虫的衰老曲线。图中横坐标为线虫寿命，纵坐标为线虫存活率。具体实施方式下面给出的实施例子是对本专利技术作进一步说明，以便于本专业技术人员更全面地理解本专利技术。但所给出的实施例不能理解为对本专利技术保护范围的限制，因而该专业的技术人员根据上述
技术实现思路
所做出的非本质的改进和调整也应属于本专利技术保护范围。实施例1首先将人胚肾上皮细胞(HEK293)培养于DMEM培养基中，DMEM培养基中含有10％(体积百分数)去除外泌体的胎牛血清(FBS)，培养条件为37℃，5％(体积百分数)二氧化碳环境，待细胞融合度达90％后，获得HEK293细胞上清液500mL。将上述HEK293细胞上清通过300g离心10min去除悬浮细胞，2000g离心10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种外泌体‑超氧化物歧化酶纳米制剂的制备方法，其步骤如下：(1)获得外泌体供体细胞的上清液400～600mL，然后在200～400g条件下离心10～20min去除悬浮细胞，再在2000～4000g条件下离心10～20min去除细胞碎片，最后在8000～12000g条件下离心20～40min去除较大的颗粒状物质；(2)将步骤(1)获得的上清液经0.22μm的滤膜过滤，去除大于220nm的颗粒，再将上清液经过100kDa截留分子量的超滤离心管进行浓缩，收集超滤离心管上层浓缩液；(3)将步骤(2)得到的浓缩液在90000～110000g条件下离心1～2h，去除上清液，保留沉淀外泌体；然后用PBS缓冲液重悬此沉淀外泌体，在相同的条件下再次离心，去除上清液，保留沉淀外泌体；最后再以1～2mL的PBS缓冲液重悬此沉淀外泌体，其中外泌体的浓度为1～3mg/mL；(4)将超氧化物歧化酶和皂素加入到步骤(3)得到的溶有外泌体的PBS缓冲液中，然后装入基于注射器的脂质体挤出器，挤压通过100nm聚碳酸酯膜20～30次；挤压过程中，外泌体膜被破坏，与超氧化物歧化酶剧烈混合；外泌体载药后通过90000～110000g离心除去游离的超氧化物歧化酶和皂素，离心产物以PBS缓冲液重悬后得到外泌体‑超氧化物歧化酶纳米制剂。...

【技术特征摘要】
1.一种外泌体-超氧化物歧化酶纳米制剂的制备方法，其步骤如下：(1)获得外泌体供体细胞的上清液400～600mL，然后在200～400g条件下离心10～20min去除悬浮细胞，再在2000～4000g条件下离心10～20min去除细胞碎片，最后在8000～12000g条件下离心20～40min去除较大的颗粒状物质；(2)将步骤(1)获得的上清液经0.22μm的滤膜过滤，去除大于220nm的颗粒，再将上清液经过100kDa截留分子量的超滤离心管进行浓缩，收集超滤离心管上层浓缩液；(3)将步骤(2)得到的浓缩液在90000～110000g条件下离心1～2h，去除上清液，保留沉淀外泌体；然后用PBS缓冲液重悬此沉淀外泌体，在相同的条件下再次离心，去除上清液，保留沉淀外泌体；最后再以1～2mL的PBS缓冲液重悬此沉淀外泌体，其中外泌体的浓度为1～3mg/mL...

【专利技术属性】
技术研发人员：李全顺，邵新欣，李青，刘勇，梁骁，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22