利用隐性颖壳颜色性状提高水稻遗传工程核不育系种子色选精度的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用隐性颖壳颜色性状提高水稻遗传工程核不育系种子色选精度的方法，将隐性异色颖壳可育水稻材料培育成双色选遗传工程核不育系；将包含黄颖基因、育性恢复基因、花粉失活基因和荧光标记基因的四元连锁载体导入至双色选遗传工程核不育系的基因组中培育双色选遗传工程繁殖系；将双色选遗传工程繁殖系和与双色选遗传工程核不育系混植，混收全部种子；第一次荧光筛选，分离无荧光的不育系种子和发荧光的繁殖系种子；第二次颖壳颜色筛选，提纯异色颖壳不育系种子。本发明专利技术利用水稻隐性异色颖壳作为新的色选标记提高遗传工程核不育系种子在分选过程中的纯度，实现遗传工程核不育系纯度达到生产应用标准的目标。

A Method for Improving the Precision of Seed Color Selection of Genetic Engineering Genic Male Sterile Lines in Rice by Using Recessive Glume Color Characters

【技术实现步骤摘要】
利用隐性颖壳颜色性状提高水稻遗传工程核不育系种子色选精度的方法
本专利技术涉及水稻基因工程
，尤其涉及利用隐性颖壳颜色性状提高水稻遗传工程核不育系种子色选精度的方法。
技术介绍
遗传工程核不育系的本质是普通核不育水稻，因而继承了普通核不育水稻具有的育性稳定、不育彻底和易于配制高产、优质、多抗杂交组合的优点，可避免当前三系不育系配组受严格的恢保关系限制和两系不育系制种受气温波动的影响。以遗传工程核不育系为基础的第三代杂交水稻育种技术是目前最理想、最便捷、最高效的杂种优势利用方式，该技术的规模化和产业化的应用，必将全面促进我国水稻生产向优质、稳产、绿色、高效、可持续发展的方式转变，对确保我国杂交水稻技术世界领先地位具有重要意义。遗传工程核不育系的繁殖和分选是第三代杂交水稻技术的核心技术，现已实现了遗传工程不育系种子的批量繁殖和胚乳荧光分选技术(参见专利ZL201210426678.7)，为遗传工程核不育系的产业化奠定了基础。然而，在利用现有荧光分选技术分离不育系种子的过程中，由于水稻胚乳被颖壳包裹，降低了荧光蛋白从胚乳往颖壳外散发荧光的强度，干扰了色选机的色选精度，所分选出的遗传工程不育系往往含有少数几粒带有转基因成分的繁殖系种子。由于当前公众对转基因非常敏感，国家也未放开对转基因产品的限制，如果在制种环节不育系种子中混入几粒携带转基因成分的繁殖系种子，将会导致生产出来的杂交种子中含有少数携带转基因成分的种子，从而严重阻碍第三代杂交水稻的推广和应用。水稻正常的颖壳颜色为黄色，而黑色、褐色或红色等不同于黄色的颖壳则称为异色颖壳。如果可以通过水稻隐性异色颖壳性状作为第二色选标记，构建遗传工程核不育系的双色选分离体系，通过胚乳是否发荧光和谷壳的不同颜色这两种色选性状建立两套色选程序，可以显著提高色选精度，实现遗传工程不育系纯度达到生产应用的标准。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种利用隐性颖壳颜色性状提高水稻遗传工程核不育系种子色选精度的方法，利用水稻隐性异色颖壳作为新的色选标记提高遗传工程核不育系种子在分选过程中的纯度，实现遗传工程核不育系纯度达到生产应用标准的目标。利用该方法获得的遗传工程不育系种子的颖壳颜色不同于正常水稻的黄色，能够用于机械化制种。为解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案为：一种利用隐性颖壳颜色性状提高水稻遗传工程核不育系种子色选精度的方法，包括以下步骤：S1、将隐性异色颖壳可育水稻材料培育成双色选遗传工程核不育系；S2、将包含黄颖基因、育性恢复基因、花粉失活基因和荧光标记基因的四元连锁载体导入至所述S1中所述双色选遗传工程核不育系的基因组中培育双色选遗传工程繁殖系；S3、将所述S2中所述双色选遗传工程繁殖系和与所述S1中所述双色选遗传工程核不育系混植，开花期将所述双色选遗传工程繁殖系的花粉赶到所述双色选遗传工程核不育系植株上，混收全部种子；S4、根据胚乳是否发荧光对所述S3中混收的种子进行第一次筛选，将发荧光的黄颖遗传工程繁殖系种子和不发荧光的遗传工程核不育系种子分选出来；所述不发荧光的遗传工程核不育系种子包括异色颖壳不育系种子和黄色颖壳不育系种子，所述异色颖壳不育系种子来源于双色选遗传工程核不育系植株，所述黄色颖壳不育系种子来源于双色选遗传工程繁殖系植株；S5、根据颖壳颜色对所述S4中不育系种子进行第二次色选，将黄色颖壳不育系种子及第一次色选过程中混入的少量黄颖遗传工程繁殖系种子分选出来，提纯异色颖壳不育系种子。上述的方法，进一步的，所述隐性异色颖壳可育水稻材料采用以下方法培育：通过编辑水稻野生型隐性颖壳颜色控制基因培育；或，通过回交方法导入突变的隐性颖壳颜色控制基因培育。上述的方法，进一步的，所述S1中所述隐性异色颖壳可育水稻材料的培育方法为：S1-A1、根据OsCHI基因的cDNA序列设计靶位点接头引物Seq2和Seq3，所述Seq2的DNA序列如SEQIDNO.2所示；所述Seq3的DNA序列如SEQIDNO.3所示；S1-A2、将所述靶位点接头引物Seq2和Seq3制成具有粘性末端的双链接头OsCHI-T1；S1-A3、将所述双链接头OsCHI-T1与载体连接得到pU3-OsCHI-T1-gRNA重组载体；S1-A4、将所述pU3-OsCHI-T1-gRNA重组载体连接到pCRISPR/Cas9载体得到pCas9-OsCHI-T1敲除载体；S1-A5、将所述pCas9-OsCHI-T1敲除载体转化至水稻愈伤组织中，获得带有隐性异色颖壳的可育水稻。上述的方法，进一步的，所述S1中所述双色选遗传工程核不育系通过编辑水稻野生型隐性雄性核不育基因获得；或，通过回交方法导入突变的隐性核不育基因获得。上述的方法，进一步的，所述S1中所述双色选遗传工程核不育系采用以下方法获得：S1-B1、根据PTC1基因的cDNA序列设计靶位点接头引物Seq7和Seq8,所述Seq7的DNA序列如SEQIDNO.7所示；所述Seq8的DNA序列如SEQIDNO.8所示；S1-B2、将所述靶位点接头引物Seq7和Seq8制成具有粘性末端的双链接头PTC1-T1；S1-B3、将所述双链接头PTC1-T1与载体连接得到pU3-PTC1-T1-gRNA重组载体；S1-B4、将所述pU3-PTC1-T1-gRNA重组载体连接到pCRISPR/Cas9载体得到pCas9-PTC1-T1敲除载体；S1-B5、将所述pCas9-PTC1-T1敲除载体导入带有隐性异色颖壳的可育水稻的愈伤组织中，转育成双色选遗传工程核不育系。上述的方法，进一步的，所述S2具体为：S2-1、设计扩增黄颖基因、育性恢复基因、花粉失活基因和荧光标记基因的引物，进行PCR扩增获得基因片段，S2-2、将所述四个基因的基因片段构建到同一植物表达载体中得到四元连锁载体；S2-3、将所述四元连锁载体导入到所述双色选遗传工程核不育系的基因组中获得转基因植株；S2-4、从所述转基因植株中选择颖壳颜色恢复为黄色且后代种子中50％为荧光种子的株系，即为双色选遗传工程繁殖系。上述的方法，进一步的，所述黄颖基因为OsCHI、OsCAD2或IBF1；所述育性恢复基因为PTC1、EAT1、TDR或CYP704B2；所述花粉失活基因为ZMAA；所述荧光标记基因为DsRed。上述的方法，进一步的，所述黄颖基因为OsCHI，扩增所述OsCHI基因的引物为CHI-F和CHI-R，所述CHI-F的DNA序列如SEQIDNO.19所示；所述CHI-R的DNA序列如SEQIDNO.20所示；所述育性恢复基因为PTC1基因，扩增所述PTC1基因的引物为PTC1-F和PTC1-R，所述PTC1-F的DNA序列如SEQIDNO.21所示；所述PTC1-R的DNA序列如SEQIDNO.22所示；扩增所述ZMAA基因的引物为ZMAA-F和ZMAA-R，所述ZMAA-F的DNA序列如SEQIDNO.23所示；所述ZMAA-R的DNA序列如SEQIDNO.24所示；扩增所述DsRed基因的引物为DsRed-F和DsRed-R，所述DsRed-F的DNA序列如SEQIDNO.25所示；所述DsRed-R的DNA序列如SEQIDNO.26所示。上述的方法，进一步本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用隐性颖壳颜色性状提高水稻遗传工程核不育系种子色选精度的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将隐性异色颖壳可育水稻材料培育成双色选遗传工程核不育系；S2、将包含黄颖基因、育性恢复基因、花粉失活基因和荧光标记基因的四元连锁载体导入至所述S1中所述双色选遗传工程核不育系的基因组中培育双色选遗传工程繁殖系；S3、将所述S2中所述双色选遗传工程繁殖系和与所述S1中所述双色选遗传工程核不育系混植，开花期将所述双色选遗传工程繁殖系的花粉赶到所述双色选遗传工程核不育系植株上，混收全部种子；S4、根据胚乳是否发荧光对所述S3中混收的种子进行第一次筛选，将发荧光的黄颖遗传工程繁殖系种子和不发荧光的遗传工程核不育系种子分选出来；所述不发荧光的遗传工程核不育系种子包括异色颖壳不育系种子和黄色颖壳不育系种子，所述异色颖壳不育系种子来源于双色选遗传工程核不育系植株，所述黄色颖壳不育系种子来源于双色选遗传工程繁殖系植株；S5、根据颖壳颜色对所述S4中不育系种子进行第二次色选，将黄色颖壳不育系种子及第一次色选过程中混入的少量黄颖遗传工程繁殖系种子分选出来，提纯异色颖壳不育系种子。

【技术特征摘要】
1.一种利用隐性颖壳颜色性状提高水稻遗传工程核不育系种子色选精度的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将隐性异色颖壳可育水稻材料培育成双色选遗传工程核不育系；S2、将包含黄颖基因、育性恢复基因、花粉失活基因和荧光标记基因的四元连锁载体导入至所述S1中所述双色选遗传工程核不育系的基因组中培育双色选遗传工程繁殖系；S3、将所述S2中所述双色选遗传工程繁殖系和与所述S1中所述双色选遗传工程核不育系混植，开花期将所述双色选遗传工程繁殖系的花粉赶到所述双色选遗传工程核不育系植株上，混收全部种子；S4、根据胚乳是否发荧光对所述S3中混收的种子进行第一次筛选，将发荧光的黄颖遗传工程繁殖系种子和不发荧光的遗传工程核不育系种子分选出来；所述不发荧光的遗传工程核不育系种子包括异色颖壳不育系种子和黄色颖壳不育系种子，所述异色颖壳不育系种子来源于双色选遗传工程核不育系植株，所述黄色颖壳不育系种子来源于双色选遗传工程繁殖系植株；S5、根据颖壳颜色对所述S4中不育系种子进行第二次色选，将黄色颖壳不育系种子及第一次色选过程中混入的少量黄颖遗传工程繁殖系种子分选出来，提纯异色颖壳不育系种子。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述隐性异色颖壳可育水稻材料采用以下方法培育：通过编辑水稻野生型隐性颖壳颜色控制基因培育；或，通过回交方法导入突变的隐性颖壳颜色控制基因培育。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1中所述隐性异色颖壳可育水稻材料的培育方法为：S1-A1、根据OsCHI基因的cDNA序列设计靶位点接头引物Seq2和Seq3，所述Seq2的DNA序列如SEQIDNO.2所示；所述Seq3的DNA序列如SEQIDNO.3所示；S1-A2、将所述靶位点接头引物Seq2和Seq3制成具有粘性末端的双链接头OsCHI-T1；S1-A3、将所述双链接头OsCHI-T1与载体连接得到pU3-OsCHI-T1-gRNA重组载体；S1-A4、将所述pU3-OsCHI-T1-gRNA重组载体连接到pCRISPR/Cas9载体得到pCas9-OsCHI-T1敲除载体；S1-A5、将所述pCas9-OsCHI-T1敲除载体转化至水稻愈伤组织中，获得带有隐性异色颖壳的可育水稻。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1中所述双色选遗传工程核不育系通过编辑水稻野生型隐性雄性核不育基因获得；或，通过回交方法导入突变的隐性核不育基因获得。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1中所述双色选遗传工程核不育系采用以下方法获得：S1-B1、根据PTC1基因的cDNA序列设计靶位点接头引物Seq7和Seq8；所述Seq7的DNA序列如SEQIDNO.7所示；所述Se...

【专利技术属性】
技术研发人员：余东，袁定阳，段美娟，李新奇，李莉，孙志忠，孙学武，谭炎宁，盛夏冰，袁贵龙，袁隆平，
申请(专利权)人：湖南杂交水稻研究中心，湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43