定量联合检测C-反应蛋白与血清淀粉样蛋白A的时间分辨免疫层析试纸条及其制备方法技术

本发明专利技术揭示了一种定量检测C‑反应蛋白与血清淀粉样蛋白A的试纸条的制备方法，包括：将硝酸纤维素膜包被检测线与质控线，检测线分别使用CRP和SAA包被抗体，质控线分别使用CRP和SAA捕获抗体的二抗；制备结合垫，其包括：离心洗涤捕获抗体，将纳米增强型时间分辨荧光微球与CRP捕获抗体溶解于PBS，加入EDC室温反应30min‑12h；加入封闭液封闭30min‑12小时；离心后PBS洗涤沉淀，使用微球稀释液稀释后定量喷涂到第一载体；其中，捕获抗体为CRP捕获抗体和SAA捕获抗体；还包括制备样品垫，包括将第二载体浸泡于含有0.9％NaCl和0.5‑3％的表面活性剂S9的水溶液中，然后烘干。

Time-resolved immunochromatographic strip for quantitative detection of C-reactive protein and serum amyloid A and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
定量联合检测C-反应蛋白与血清淀粉样蛋白A的时间分辨免疫层析试纸条及其制备方法
本专利技术涉及临床免疫学检测领域，具体涉及一种采用时间分辨免疫层析技术进行定量检测试纸条及其制备方法。
技术介绍
C-反应蛋白(CRP)是机体非特异性免疫机制的一部分，它结合C-多糖，在Ca2+存在时可结合细胞膜上磷酸胆碱，激活补体的经典途径，增强白细胞的吞噬作用，调节淋巴细胞或单核/巨噬系统功能，促进巨噬细胞组织因子的生成。在动脉粥样硬化斑块中也可检测到CRP。人CRP主要生物学功能：通过与配体(凋亡与坏死的细胞，或入侵的细菌、真菌、寄生虫等的磷酰胆碱)结合，激活补体和单核吞噬细胞系统，将载有配体的病理物质或病原体清除。血清淀粉样蛋白A(SAA)是一种由肝细胞产生后被分泌到血清中的急性时相蛋白，当机体发生感染或损伤时,可在4-6h内迅速升高约1000倍，当机体抗原清除后则迅速降低至正常水平。因此，SAA是反映机体感染情况和炎症恢复的灵敏指标。与目前临床广泛使用的CRP相比较，SAA升高见于病毒、支原体、细菌感染，且敏感性高于CRP，而CRP升高见于细菌感染，对于病毒、支原体等病原体感染CRP不升高或仅轻微升高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供应用于临床的联合检测CRP与SAA的定量检测试纸条，以提供高灵敏度、特异性的检测，满足临床的需求。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供定量检测CRP和SAA的时间分辨免疫层析试纸条的制备方法，包括，将硝酸纤维素膜包被检测线与质控线，所述检测线使用CRP和SAA包被抗体，所述质控线分别使用CRP和SAA捕获抗体的二抗；还包括制备结合垫，其包括：使用洗涤液离心洗涤捕获抗体，所述洗涤液为硼酸缓冲液；纳米增强型时间分辨荧光微球与CRP捕获抗体溶解于PH6、浓度0.05mol/L的PBS，加入EDC使终浓度为10mg/ml，室温反应30min-12h；加入封闭液封闭30min-12h，所述封闭液含有0.1-1％F68、10-50mmol/ml甘氨酸；离心后PBS洗涤沉淀，使用微球稀释液稀释到30-120倍，所述微球稀释液为PBS溶液，所述PBS溶液含有1-3％吐温20及20％海藻糖或蔗糖；将稀释的微球定量喷涂到第一载体；还包括制备样品垫，其包括将第二载体浸泡于含有0.9％NaCl和0.5-3％的表面活性剂S9的水溶液中，然后烘干；其中，捕获抗体为CRP捕获抗体和SAA捕获抗体；所述百分比为质量百分比浓度。因活化的—COOH易导致抗体分子之间的聚集，通过改进抗体与微球偶联过程，将活化的羧基保护起来，利于提高抗体的偶联效率。与现有技术相比，采用本方法制备结合垫可减少活化抗体自身的聚集，提高偶联效率。作为本专利技术一实施方式的进一步改进，纳米增强型时间分辨荧光微球与捕获抗体溶解于PH6、浓度0.05mol/L的PBS，加入EDC使终浓度为10mg/ml，室温反应30min；加入封闭液封闭12h，封闭液含有1％F68、50mmol/ml甘氨酸；离心后PBS洗涤沉淀，使用微球稀释液稀释到120倍，微球稀释液为PBS溶液，PBS溶液含有3％吐温20及20％海藻糖或蔗糖。作为本专利技术一实施方式的进一步改进，纳米增强型时间分辨荧光微球与捕获抗体溶解于PH8、浓度0.05mol/L的PBS，加入EDC使终浓度为10mg/ml，室温反应12h；加入封闭液封闭30min，封闭液含有0.1％F68、10mmol/ml甘氨酸；离心后PBS洗涤沉淀，使用微球稀释液稀释到30倍，微球稀释液为PBS溶液，PBS溶液含有1％吐温20及20％海藻糖或蔗糖。作为本专利技术一实施方式的进一步改进，纳米增强型时间分辨荧光微球直径为100nm-300nm。作为本专利技术一实施方式的进一步改进，捕获抗体与微球混合的重量比是1/5-1/20。作为本专利技术一实施方式的进一步改进，捕获抗体的洗涤液为PH8-9的0.05硼酸缓冲液。作为本专利技术一实施方式的进一步改进，第一载体为玻璃纤维膜。作为本专利技术一实施方式的进一步改进，第二载体为玻璃纤维膜。为实现上述目的，本专利技术一实施方式提供一种定量检测CRP与SAA的时间分辨免疫层析试纸条，由底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成，所述底板、硝酸纤维素膜、吸水纸、结合垫、样品垫依次交错黏贴，该试纸条由上述任一所述的方法制得。与现有技术相比，本专利技术通过将双抗体夹心法和时间分辨免疫层析技术引入CRP与SAA的检测中，结合荧光检测仪，实现了CRP与SAA的定量检测，且灵敏度高，批内、批间差小，为临床使用提供了极大便利。附图说明图1是本专利技术实施例1CRP检测的标准曲线图；图2是本专利技术实施例1SAA检测的标准曲线图；图3是本专利技术实施例2CRP检测的标准曲线图；图4是本专利技术实施例2SAA检测的标准曲线图。具体实施方式以下将结合附图所示的具体实施方式对本专利技术进行详细描述。但这些实施方式并不限制本专利技术，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的结构、方法、或功能上的变换均包含在本专利技术的保护范围内。本专利技术提供的试纸条由塑料卡壳、底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜(NC膜)和吸水纸组成。结合垫上包被有纳米增强型时间分辨荧光微球标记的CRP捕获抗体与SAA捕获抗体(captureantibody)。NC膜上包被有检测线和质控线，其中，检测线固定有识别不同抗原表位的CRP与SAA包被抗体(testantibody)，质控线固定有能结合抗CRP与SAA捕获抗体的二抗。结合垫为玻璃纤维膜，其上喷涂了连接有抗体的纳米增强型时间分辨微球。NC膜上包被的检测线和质控线相互平行，并且相互之间保持一定间隔。纳米增强型时间分辨荧光微球选用直径100nm-300nm的微球。试纸条装于塑料卡壳内，在湿度小于35％的环境中组装。本专利技术的试纸条由如下步骤制得：NC膜上制备检测线和质控线，检测线分别为CRP与SAA包被抗体，质控线为能结合CRP与SAA捕获抗体的二抗；玻璃纤维膜上喷涂连接有CRP与SAA捕获抗体的纳米增强型时间分辨微球，制得结合垫；处理玻璃纤维膜，使玻璃纤维膜上含有一定量的表面活性剂等，制得样品垫；底板、NC膜、吸水纸、结合垫、样品垫依次交错黏贴，切割成相应尺寸，装入塑料卡壳。其中，NC膜上包被检测线、质控线的方法包括如下步骤：检测线使用CRP与SAA包被抗体，用量为每检测线0.5-2.5mg。抗体使用稀释液稀释到浓度范围后使用，稀释液选择PBS+(1-10)％海藻糖+(0-5)％NaCl。质控线使用抗CRP与SAA捕获抗体的二抗，用量为每质控线0.5-2.5mg。高于此浓度的抗体使用稀释液稀释到浓度范围后使用，稀释液选择PBS+(1-10)％海藻糖+(0-5)％NaCl。使用定量喷膜仪以1-2ul/cm的浓度将上述二种抗体分划于NC膜上，保持两线间隔0.5cm以上。25-60℃烘干1-5小时，干燥保存。结合垫的制作方法包括如下步骤：制作CRP结合垫：CRP捕获抗体使用的超滤离心管洗涤3遍，洗涤液为PH8-9的0.05硼酸缓冲液；纳米增强型时间分辨荧光微球与CRP捕获抗体溶解于PH6-8、浓度0.05mol/L的PBS，控制抗体与微球重量比为1/5-1/20，加入EDC使终浓度为10mg/ml，室温反应30min-12h。加入封闭液封闭，反应3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.定量检测C‑反应蛋白与血清淀粉样蛋白A的时间分辨免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述方法包括，将硝酸纤维素膜包被检测线与质控线，所述检测线分别使用CRP和SAA包被抗体，所述质控线分别使用CRP和SAA捕获抗体的二抗；还包括制备结合垫，其包括：使用洗涤液离心洗涤捕获抗体，所述洗涤液为硼酸缓冲液；纳米增强型时间分辨荧光微球与捕获抗体溶解于PH6‑8、浓度0.05mol/L的PBS，加入EDC使终浓度为10mg/ml，室温反应30min‑12h；加入封闭液封闭30min‑12h，所述封闭液含有0.1‑1％F68、10‑50mmol/ml甘氨酸；离心后PBS洗涤沉淀，使用微球稀释液稀释到30‑120倍，所述微球稀释液为PBS溶液，所述PBS溶液含有1‑3％吐温20及20％海藻糖或蔗糖；将稀释的微球定量喷涂到第一载体；还包括制备样品垫，其包括将第二载体浸泡于含有0.9％NaCl和0.5‑3％表面活性剂S9的水溶液中，然后烘干；其中，所述捕获抗体分别为CRP捕获抗体和SAA捕获抗体；所述百分比浓度为质量百分比。

【技术特征摘要】
1.定量检测C-反应蛋白与血清淀粉样蛋白A的时间分辨免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述方法包括，将硝酸纤维素膜包被检测线与质控线，所述检测线分别使用CRP和SAA包被抗体，所述质控线分别使用CRP和SAA捕获抗体的二抗；还包括制备结合垫，其包括：使用洗涤液离心洗涤捕获抗体，所述洗涤液为硼酸缓冲液；纳米增强型时间分辨荧光微球与捕获抗体溶解于PH6-8、浓度0.05mol/L的PBS，加入EDC使终浓度为10mg/ml，室温反应30min-12h；加入封闭液封闭30min-12h，所述封闭液含有0.1-1％F68、10-50mmol/ml甘氨酸；离心后PBS洗涤沉淀，使用微球稀释液稀释到30-120倍，所述微球稀释液为PBS溶液，所述PBS溶液含有1-3％吐温20及20％海藻糖或蔗糖；将稀释的微球定量喷涂到第一载体；还包括制备样品垫，其包括将第二载体浸泡于含有0.9％NaCl和0.5-3％表面活性剂S9的水溶液中，然后烘干；其中，所述捕获抗体分别为CRP捕获抗体和SAA捕获抗体；所述百分比浓度为质量百分比。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纳米增强型时间分辨荧光微球与捕获抗体溶解于PH6、浓度0.05mol/L的PBS，加入EDC使终浓度为10mg/ml，室温反应30min；加入封闭液封闭12h，所述封闭液含有1％F68、50mmol/ml甘氨酸；离...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘佳佳，邵伟，王丽君，
申请(专利权)人：苏州遵道生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32