一种基于超临界二氧化碳体系酶解纤维素的方法技术

本发明专利技术涉及纤维素酶解技术领域，公开了一种基于超临界二氧化碳体系酶解纤维素的方法。该方法将微晶纤维素、修饰纤维素酶以及缓冲溶液搅拌均匀，然后暴露于超临界二氧化碳系统中进行纤维素的均相酶解反应，直接得到还原糖。该方法可直接得到高含量的还原糖，并且本发明专利技术提供的修饰纤维素酶在反应过程中始终保持较高的催化活性和稳定性，能够很好地促进纤维素降解。

A method of enzymatic hydrolysis of cellulose based on supercritical carbon dioxide system

【技术实现步骤摘要】
一种基于超临界二氧化碳体系酶解纤维素的方法
本专利技术涉及纤维素的酶解，特别涉及一种基于超临界二氧化碳体系酶解纤维素的方法。
技术介绍
纤维素作为重要的可再生资源，在全球能源的发展中有着举足轻重的地位。如何合理有效的利用纤维素，已成为生物质领域研究的热点问题，纤维素水解制糖，然后以糖为平台化合物，合成各种重要的化学品，是缓解石化危机，发展低碳经济的关键，目前纤维素水解制备还原糖主要有酸水解和酶水解。酸水解作为纤维素降解过程中最常见的水解方法，已较早的实现了工业化，但却存在能耗高、设备易腐蚀、环境污染严重等缺点，因此人们对酶水解纤维素越来越重视；酶水解始于20世纪50年代，主要利用纤维素酶对生物质中的纤维素进行水解，酶解纤维素是在常温常压下进行，能耗低，选择性好，效率高，对环境无污染，得到的还原糖产率也较高，越来越多的酶水解纤维素实现了工业化，酶水解在纤维素水解过程中表现出了巨大的工业发展潜力。专利技术人先后申请过纤维素酶解方法相关专利，比如中国专利CN102586362A一种在氯化1-甲基3-丁基咪唑盐离子液体下修饰纤维素酶原位酶解微晶纤维素的新方法，为了实现均相酶解，专利技术人采用了离子液体作为酶解介质，离子液体极性较强，故专利技术人采用采用聚乙二醇衍生物为修饰剂修饰纤维素酶，该修饰酶抗极性强，能够在极性较强的离子液体介质中保持较强的酶活，但是离子液体价格昂贵，而且最终制备得到的还原糖需要经过浓缩、蒸馏等复杂分离步骤才能得到高纯还原糖。比如中国专利CN104830926A公开了一种均相酶解纤维素的方法，所制备的修饰纤维素酶稳定性高且具有温敏性，在强碱性的氢氧化钠/尿素水溶液中仍能保持高的活性和温控性，实现了酶的高效回收和重复使用，同样其制备的得到的还原糖同样需要经过浓缩、蒸馏等复杂分离步骤才能得到高纯还原糖。在现有技术的纤维素酶解方法中，无论是酸水解还是酶水解纤维素，均存在一个主要的问题是水解后无法直接得到高含量的还原糖，这将限制纤维素的深入应用，如何直接有效的获得高含量的还原糖是目前纤维素酶解过程迫切需要解决的问题。因此，本专利技术提供了一种基于超临界二氧化碳体系酶解纤维素的方法，直接有效的获得高含量还原糖以推动纤维素的深入应用。
技术实现思路
为了解决现有技术中的酶水解纤维素后无法直接得到高含量的还原糖的问题，本专利技术提供了一种基于超临界二氧化碳体系酶解纤维素的方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：采用右旋糖酐修饰纤维素酶的还原端氨基形成右旋糖酐修饰纤维素酶，将微晶纤维素、所述右旋糖酐修饰纤维素酶以及缓冲溶液搅拌均匀，然后暴露于超临界二氧化碳系统中进行纤维素的均相酶解反应，直接得到还原糖；所述均相酶解反应的反应时间为24h，反应压力为8.2MPa，反应温度为50℃。目前超临界二氧化碳作为一种低耗环保溶剂，已引起了很多研究者的兴趣，本专利技术将其引入到纤维素酶解过程中，用其溶解纤维素，可实现均相酶解，酶解反应结束后，超临界二氧化碳以气体的形式与产物分离，无需经过浓缩、蒸馏等复杂分离步骤，就可以得到高含量的还原糖，超临界二氧化碳将会是推动纤维素应用的一种具有良好发展潜力的酶解介质，但是如果采用超临界二氧化碳作为酶解介质，温度和压力会相应增大，尤其是压力过大会使纤维素酶失活，因此，本专利技术提供了上述修饰纤维素酶，可以保证在超临界二氧化碳体系的反应过程中始终保持较高的的酶活性。本专利技术提供的所述右旋糖酐的分子量为2000、5000、10000、20000或40000，可以采用分子量为2000、5000、10000、20000或40000的右旋糖酐的定点修饰纤维素酶的末端氨基，制得修饰纤维素酶，可以分别标记为Cell-DEX2k、Cell-DEX5k、Cell-DEX10k、Cell-DEX20k或Cell-DEX40k。作为优选，所述微晶纤维素的分子量为2.5-5万，聚合度为153-300，灰分＜0.6％，粒径25-190μm。本专利技术提供的右旋糖酐修饰纤维素酶的制备方法具体为：将天然纤维素酶加入所述缓冲溶液中，待其完全溶解后，加入与所述天然纤维素酶等质量的右旋糖酐，混合均匀后，加入还原剂氰基硼氢钠(NaCNBH3)恒温反应，然后加入甘氨酸终止反应，最后透析纯化得到所述修饰纤维素酶。通过工艺优化，得到最优条件，所述还原剂氰基硼氢钠(NaCNBH3)的质量为所述右旋糖酐质量的30-50％；所述甘氨酸的质量为所述天然纤维素酶质量20倍。本专利技术所提供的恒温反应的反应时间为24h，反应温度为30-35℃。本专利技术所提供的缓冲溶液均为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，所述缓冲溶液的pH为4.8。与现有技术相比，本专利技术提供了一种基于超临界二氧化碳体系酶解纤维素的方法，本专利技术将超临界二氧化碳引入到纤维素酶解过程中，用其溶解纤维素，可实现均相酶解，超临界二氧化碳以气体的形式与产物分离可直接得到高含量的还原糖；同时本专利技术提供的修饰纤维素酶能够抵制超临界二氧化碳体系下压力环境引起的酶失活，使酶在反应过程中始终保持较高的催化活性和稳定性，很好地促进纤维素降解，并可回收纤维素酶；本专利技术提供的超临界二氧化碳将会是推动纤维素应用的一种具有良好发展潜力的酶解介质，从而扩大纤维素的深入应用。具体实施方式本专利技术公开了一种基于超临界二氧化碳体系酶解纤维素的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术当中。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。为了使本领域技术人员能够更好的理解本专利技术，下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步的详细说明。需要说明的是，本专利技术实施例和对比例中的还原糖量的测定方法如下：DNS试剂：1.6gDNS和21gNaOH，加入到200mL水中溶解，185g酒石酸钾钠溶于500mL水中，与上溶液混合加入5g结晶酚，5g无水亚硫酸钠搅拌溶解，冷却定容于1000mL容量瓶，储于棕色瓶中7-10天后使用。葡萄糖标准曲线：将葡萄糖在105℃下烘干2h至恒重，精确称取0.1g用蒸馏水溶解，并定容到100mL此浓度为1.0mg/mL。取10支20mL的具塞刻度试管，依次加入0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL、1.8mL葡萄糖标准溶液，然后每支试管中加入蒸馏水，总体积为2.0mL，再分别加入0.5mLDNS试剂，摇均后在沸水中准确放置5min，取出用流水迅速冷却，用蒸馏水定容至20mL，充分摇均后静置20min。最后在波长540nm处测各比色管中溶液的吸光值A，以吸光值作纵坐标，相应葡萄糖浓度C(mg/mL)作横坐标，得到葡萄糖标准曲线。使用紫外-可见分管光度计在540nm下测定纤维素酶解还原糖的吸光度值，代入葡萄糖标准曲线，得到还原糖量。实施例1在装有温度计、冷凝管和转子的50mL三口瓶中加入30mL的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液(pH＝4.8)，设定水浴加热温度为30℃，待瓶内温度稳定后加入150mg天然纤维素酶，待其完全溶解后，缓慢加入150mg的分子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于超临界二氧化碳体系酶解纤维素的方法，其特征在于：采用右旋糖酐修饰纤维素酶的氨基还原端形成右旋糖酐修饰纤维素酶，将微晶纤维素、所述右旋糖酐修饰纤维素酶以及缓冲溶液搅拌均匀，然后暴露在超临界二氧化碳体系中进行纤维素的均相酶解反应，直接得到还原糖；所述均相酶解反应的反应时间为24h，反应压力为8.2MPa，反应温度为50℃。

【技术特征摘要】
1.一种基于超临界二氧化碳体系酶解纤维素的方法，其特征在于：采用右旋糖酐修饰纤维素酶的氨基还原端形成右旋糖酐修饰纤维素酶，将微晶纤维素、所述右旋糖酐修饰纤维素酶以及缓冲溶液搅拌均匀，然后暴露在超临界二氧化碳体系中进行纤维素的均相酶解反应，直接得到还原糖；所述均相酶解反应的反应时间为24h，反应压力为8.2MPa，反应温度为50℃。2.如权利要求1所述的基于超临界二氧化碳体系酶解纤维素，其特征在于：所述右旋糖酐的分子量为2000、5000、10000、20000或400003.如权利要求1所述的基于超临界二氧化碳体系酶解纤维素，其特征在于：所述微晶纤维素的分子量为2.5-5万，聚合度为153-300，灰分＜0.6％，粒径25-190μm。4.如权利要求1所述的基于超临界二氧化碳体系酶解纤维素，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：李露，于世涛，李化肖，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：山东,37