本发明专利技术公开一种人正常肾小管原代细胞及其体外分离培养和应用，该细胞命名为人正常肾小管原代细胞XHRN‑01，保藏编号为CCTCC NO：C201970。其原代细胞分离培养方法为：体外获取临床术后切除肾癌旁组织，经病理学鉴定无癌细胞侵染，去除组织中血管及脂肪组织，组织样本经胶原酶/胰酶消化，过滤，低速离心获取细胞沉淀，红细胞裂解液裂解红细胞后，用COMR完全培养基重悬细胞，再通过传代培养构建细胞系。本发明专利技术的细胞可用于在人正常细胞的生理学研究、体外正常细胞药物毒性研究、肾脏及其相关疾病包括肾癌、慢性肾炎及感染性疾病的发病机理及治疗药物筛选研究中的应用。
A Human Normal Renal Tubular Primary Cell and Its Isolation, Culture and Application in Vitro
【技术实现步骤摘要】
一种人正常肾小管原代细胞及其体外分离培养和应用
本专利技术属于细胞生物学领域，更具体的，涉及一种人正常肾小管原代细胞及其体外分离培养和应用。
技术介绍
肾脏是机体血流量较大的功能器官，血液中的毒性物质能够快速到达肾脏部位，药物进入机体后，多数药物经肾小球过滤、近曲小管分泌、远曲小管重吸收和小关上皮细胞降解等代谢过程排除体外，这一过程均可累及肾脏发生结构或功能改变，导致肾毒性或肾损伤。此外，肾脏对于尿液的浓缩功能又进一步提高了肾脏细胞和肾小管腔内的毒性物质浓度；同时由于肾脏组织处于高代谢状态，需氧量大，多种酶作用活跃，极易受到缺氧、毒素、免疫因素或药物损伤。因此，肾脏极易受到外源物质的作用引起脏器病变或损伤。目前，肾脏毒性的研究模型主要为动物模型和细胞模型。传统的肾毒性研究方法是进行动物实验验证药物肾毒性，但动物实验的耗时和耗资均不具备研究优势。由于细胞分离培养技术的发展及细胞实验的经济时效性，体外细胞模型逐渐应用于药物肾毒性的评价、优化筛选及机制研究中，尤其是肾小管上皮细胞拥有庞大的转运系统及丰富的生物转化酶，对外源性读物的损害极为敏感，是研究药物肾毒性的常用细胞模型。国内外常用的细胞模型为美洲负鼠肾小管上皮细胞系(OK细胞系)、猪肾小管上皮细胞系(LLC-PK1细胞系)及人肾皮质近曲小管上皮细胞系(HK-2细胞系)，经过人为改造使其永生化，传代细胞系拥有强大的生物转化功能，并且在可控条件下能够长期接触化合物，为研究者们所青睐。然而OK细胞系和LLC-PK1细胞系均为非人类细胞，存在种属差异；HK-2虽然为人类细胞，但该细胞系的应用过程中人为导入人乳头瘤病毒HPV16的E6/E7基因，转染而使其永生化，虽然排除了实验从动物推到人的种属差异，但外源基因的导入无疑改变了细胞的遗传背景。种属间差异及外源修饰均导致基于细胞系研究的实验数据无法准确反应临床结果。原代细胞分离培养技术的发展为体外研究提供了一项新可能性，即采用原代细胞作为体外研究的模型。虽然原代细胞的培养难度高于细胞系的培养，但直接分离于组织的原代细胞的生理功能和遗传背景均与临床上保持了高度的一致性，因此原代肾细胞无疑是目前用来研究药物细胞毒性、肾毒性实验最佳的体外细胞模型。现有技术中已公开中国专利CN109022350A，依赖小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞建立细胞模型，虽然实验得到的原代肾小管上皮细胞纯度高达92％，但应用于研究急性肾损伤或慢性肾脏病肾小管上皮细胞的损伤机质，小鼠原代肾小管上皮细胞与人类之间依旧存在种属差异，不能准确地反映临床结果。现有技术中公开的文献《人肾近端小管上皮细胞的原代培养、传代及鉴定方法研究》，提供了人肾小管上皮细胞分离及培养方法，获得人肾小管上皮细胞，排除了种属差异，但人肾小管上皮细胞的传代培养代数有限，获得的子代细胞数量有限，继续培养获得的细胞形态改变至衰老死亡，不利于药物细胞毒性、肾毒性的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现今科研领域研究模型的不足，提供一种人正常肾小管原代细胞及其体外分离培养和应用。为实现上述目的，本专利技术提供一种人正常肾小管原代细胞，分类名命为XHRN-01，保藏编号为CCTCCNO：C201970。所述人正常肾小管原代细胞XHRN-01通过STR基因型鉴定，包括21个STR基因座位点，所述STR基因座位点的等位基因具体是：AMEL-X、CSF1P0-11/12、D12S391-18、D13S317-8/12、D16S539-11、D18S51-14/17、D19S433-13/15、D2S441-11/14、D21S11-28/29、D2S1338-17/24、D3S1358-15/17、D5S818-11、D6S1043-13/17、D7S820-8/11、D8S1179-10/14、FGA-22.2/24、PentaD-9/11、PentaE-11/14、TH01-7/9、TPOX-9/12、vWA-18/20，检测结果涵盖国际通用检测19个位点。由此证明，人正常肾小管原代细胞XHRN-01属于人类细胞，与现有已公开的细胞STR基因型位点对比，发现人正常肾小管原代细胞XHRN-01未被国内外登记注册，为新发现的人正常肾小管原代细胞，得到的原代细胞的生理功能和遗传背景均与临床保持了高度的一致性，为体内外肾相关疾病的发病机制分析、药物敏感性研究分析或药物毒性研究分析提供新的方向。上述人正常肾小管原代细胞XHRN-01的体外分离培养方法，包括以下步骤：S1.收集临床透明细胞癌患者手术切除的新鲜癌旁组织，用解剖镊子于显微镜下去除血管、脂肪及坏死成分，将组织剪至糜状获得组织样本；S2.将步骤S1组织样本用消化液消化，所述消化液为含胶原酶及胰酶的DMEM培养基；S3.将S2消化后的组织样本通过无菌过滤器收集细胞悬液，低速离心去上清，收集细胞沉淀；S4.在步骤S3收集的细胞沉淀加入红细胞裂解液，室温，轻柔上下颠倒促进红细胞裂解，低速离心，收集细胞沉淀；S5.将步骤S4得到的细胞沉淀用1×PBS漂洗，低速离心收集细胞沉淀；S6.COMR完全培养基重悬步骤S5得到的细胞沉淀，接种于细胞培养瓶中培养，获得体外分离培养的人正常肾小管原代细胞；S7.除去步骤S6人正常肾小管原代细胞中的旧培养基，用PBS漂洗2次后，用Accutase消化液消化单层细胞，消化时间为3-5min；S8.消化反应结束后，1000rpm离心5min，去上清，用COMR完全培养基重悬细胞沉淀，接种于培养瓶培养，培养条件为37℃，5％CO2，获得人正常肾小管原代细胞传代培养的子代细胞。优选地，上述消化液用量为10倍于组织样本体积，消化条件为37℃，60rpm震荡消化2-3.5h,消化液中胶原酶和胰酶浓度分别为1x浓度和0.25％胰酶-0.2％EDTA；进一步优选地，上述步骤S3、S4、S5中离心条件为，1000rpm，5min。进一步优选地，上述步骤S6、S8中COMR完全培养基包括：在DMEM/F12培养基中添加1mM丙酮酸钠、5％胎牛血清、1x非必需氨基酸、10ng/mL人表皮生长因子、10μg/mL人重组胰岛素、1mg/mL抗坏血酸、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.25μg/mL两性霉素B、10ng/mL硒酸钠、0.6mg/mL牛胆汁。进一步优选地，上述DMEM/F12培养基是F12培养基和DMEM培养基按照1:1制备的。进一步优选地，上述COMR完全培养基需经过0.22μm孔径滤膜过滤后使用。人正常肾小管原代细胞XHRN-01通过上述体外分离培养方法，获得人正常肾小管原代细胞XHRN-01的子代细胞，继续培养，细胞增殖时间为2-3天，传代10代时细胞状态正常，形成人正常肾小管原代细胞XHRN-01的细胞系，构建人正常肾小管原代细胞XHRN-01的细胞模型，用于体内外肾相关疾病的发病机制分析、药物敏感性研究分析或药物毒性研究分析。药物敏感性研究分析或药物毒性研究分析的原理是将测试药物添加至人正常肾小管原代细胞XHRN-01的细胞模型中，药物发挥作用后，监测细胞增殖的抑制或细胞凋亡的相关数据，评价药物对肾小管细胞的毒性反应，具体包括以下步骤：(1)将2000个/孔的人正常肾小管原代细胞XHRN-01或其子代细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种人正常肾小管原代细胞，其特征在于，分类名命为人正常肾小管原代细胞XHRN‑01，保藏编号为CCTCC NO：C201970。
【技术特征摘要】
1.一种人正常肾小管原代细胞，其特征在于，分类名命为人正常肾小管原代细胞XHRN-01，保藏编号为CCTCCNO：C201970。2.根据权利要求1所述人正常肾小管原代细胞，其特征在于，所述人正常肾小管原代细胞检测的STR基因座包含21个位点，所述STR基因座位点的等位基因具体是：AMEL-X、CSF1P0-11/12、D12S391-18、D13S317-8/12、D16S539-11、D18S51-14/17、D19S433-13/15、D2S441-11/14、D21S11-28/29、D2S1338-17/24、D3S1358-15/17、D5S818-11、D6S1043-13/17、D7S820-8/11、D8S1179-10/14、FGA-22.2/24、PentaD-9/11、PentaE-11/14、TH01-7/9、TPOX-9/12、vWA-18/20。3.一种权利要求1或2所述人正常肾小管原代细胞的体外分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.收集临床透明细胞癌患者手术切除的新鲜癌旁组织，用解剖镊子于显微镜下去除血管、脂肪及坏死成分，将组织剪至糜状获得组织样本；S2.将步骤S1组织样本用消化液消化，所述消化液为含胶原酶及胰酶的DMEM培养基；S3.将S2消化后的组织样本通过无菌过滤器收集细胞悬液，低速离心去上清，收集细胞沉淀；S4.在步骤S3收集的细胞沉淀加入红细胞裂解液，室温，轻柔...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘红亚，章小平，谌科，王前进，王鲜，史健，吕庆洋，熊之勇，
申请(专利权)人：武汉赛尔朗灵科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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