一株降解香豆素的恶臭假单胞菌及应用制造技术

本发明专利技术涉及香豆素降解菌领域，特别是指一株香豆素降解菌及其应用。所述香豆素降解菌的分类命名为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida HS‑C2），已于2019年5月13日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17758。恶臭假单胞菌可降解香豆素并生成二氢香豆素，香豆素的降解率为99.94%。

A Coumarin-degrading Pseudomonas putida and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一株降解香豆素的恶臭假单胞菌及应用
本专利技术属于生物工程领域，涉及一株降解香豆素的恶臭假单胞菌及应用，具体涉及一株恶臭假单胞菌及其培养基和作为降解香豆素、生成二氢香豆素的应用。
技术介绍
香豆素发现于1820年，广泛存在于高等植物中，尤其是豆科、芸香科、兰科、菊科、茄科、伞形科、和虎耳草科等植物，甚至在动物中和微生物代谢产物中也发现了一些香豆素。香豆素可看作是邻羟基肉桂酸的内酯，具芳香气味，常根据环上取代基和其位置的不同将香豆素分为简单香豆素、吡喃香豆素、呋喃香豆素和其他香豆素等。香豆素作为一种香料、定香剂，可添加于化妆品中。有时为了防止金属类电镀层不均匀出现小孔，也常在金属类的电镀液内添加香豆素。大部分含有香豆素母核的天然香豆素类化合物具有灭菌、除草、灭虫、以及调节植物生长等农用性活性，蛇床子素作为一种农用型具有杀菌、抑菌活性的农药已得到普遍应用。此外香豆素特殊的化学结构使它在医学治疗方面得到广泛的应用，一些植物提取的香豆素类有效成分不仅可以抗HIV，还可以抑制癌细胞增殖，为治愈难治愈性疾病带来了可能。它和香兰素一起使用可作为糖果、糕点的调味剂，也可以加入到烟草中提高烟叶的天然香气，使烟叶香味细腻浓厚，但自20世纪50年代被列为致癌物质以来，在食品和化妆品行业已较少再使用。由于香豆素被列为致癌物质，现在二氢香豆素属于香豆素的替换品，一般作为配制椰香，肉桂香等香料的添加剂。甜润清香的黑香豆酊是一种烟用添加剂，其添加到烟丝中有益于增加烟香、掩盖杂气，使烟丝香气类型向浓香型转变。香豆素作为黑香豆酊的主要成分，其对人体强大的致癌作用极大地限制了其在食品、化妆品以及烟用领域的开发使用。因此，市场上亟待寻求一种安全有效的方法降解香豆素，使其既不失去各方面优良的生物活性，又能将致癌作用消除。那么便可以在食品烟草等领域使用黑香豆酊，从而最大程度的降低成本促进发展。
技术实现思路
本专利技术为解决香豆素降解的技术难题，提供了一株恶臭假单胞菌及其培养基和作为降解香豆素、生成二氢香豆素的应用。为解决上述技术难题，采用以下技术方案：一株降解香豆素的恶臭假单胞菌，所述恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida）已于2019年5月13日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏号为CGMCCNo.17758。所述恶臭假单胞菌菌体大小为0.6-0.8μm×1.5-2.0μm，呈细杆状，无鞭毛，在平板上为乳白色圆斑状，表面光亮，边缘整齐，不透明，中央隆起。所述的恶臭假单胞菌的培养方法，步骤如下：将恶臭假单胞菌菌液按2%的接种量，接种到培养基中培养，培养条件为pH5-9，温度30℃，转速120rpm，培养12h。所述培养基配方为：K2HPO41g/L，MgSO4•7H2O0.5g/L，FeSO4•7H2O0.005g/L，NaCl0.5g/L，KH2PO40.65g/L，MnSO40.001g/L，(NH4)2•SO40.5g/L，CaCl2•2H2O0.1g/L，Na2MoO4•2H2O0.005g/L，2g/L香豆素。所述的恶臭假单胞菌作为降解香豆素、生成二氢香豆素的应用。所述恶臭假单胞菌用于降解香豆素并生成二氢香豆素，香豆素的降解率为99.94%。本专利技术的有益效果在于：（1）本申请筛选的工程菌，在以香豆素为唯一碳源的培养基中，可将香豆素降解，降解率为99.94%，并能高效降解香豆素生成二氢香豆素；二氢香豆素为无色或淡黄色液体，可用作香豆素的替代品，作为一种香料用于食品和化妆品行业，如：配制肉桂、椰子、奶油以及烟用香精。（2）本申请筛选出的恶臭假单胞菌可以在72h内将99%以上的香豆素降解，说明该菌未来可作用于黑香豆酊，消除致癌因素。附图说明图1为本专利技术恶臭假单胞菌菌落及细胞形态图，其中a为恶臭假单胞菌菌落图，b为细胞形态图。图2为恶臭假单胞菌的生长曲线与香豆素的降解曲线。图3为恶臭假单胞菌降解香豆素生成二氢香豆素的GC-MS总离子流图。具体实施方式为了使本专利技术的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本专利技术进行进一步的说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本申请的实验材料如下：香豆素培养基的配方：K2HPO41g/L，MgSO4•7H2O0.5g/L，FeSO4•7H2O0.005g/L，NaCl0.5g/L，KH2PO40.65g/L，MnSO40.001g/L，(NH4)2•SO40.5g/L，CaCl2•2H2O0.1g/L，Na2MoO4•2H2O0.005g/L，在此培养基基础上加2g/L香豆素。细菌LB培养基的公开配方：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10gNaCl，蒸馏水1L，pH至7.0。一、香豆素降解菌的筛选于河南省郑州市高新区水牛张村选取1-3块代表性核桃、柿子、玉米植株下泥土，采用五点采样法，分别从多年生核桃林、多年生柿子林、多年生农田中采集5-10cm的肥沃土壤，存入密封袋，做好记录，立刻带回实验室。分别随机取5g多年生核桃林、柿子林、农田土壤于100mL三角瓶中，加入30mL灭菌水，放入摇床30℃、转速120r/min条件下一小时摇匀。在LB培养基中接种土壤溶液，同样条件培养一天后，按2％的接种量接种到香豆素液体培养基中，培养一周，得到菌源。移取1mL经富集培养得到的菌源到30mL发酵培养基中，以不加菌源的香豆素培养基作为对照，培养12h，通过GC-MS检测，与空白对照的GC-MS检测图进行对比。挑选出能降解香豆素的菌源，再从中移取1mL依次进行梯度稀释，选择10-6浓度梯度在缺碳富香豆素培养基上进行平板涂布如图1中a所示。将涂布好的平板于培养箱中，30℃培养2-3d，挑选出形态较好的菌落反复划线分离纯化，直到平板上无杂菌落出现。二、种子液的制备将保存在斜面中的恶臭假单胞菌（PseudomonasputidaHS-C2）接种到30mL的LB培养基中，培养12h后备用。三、香豆素的细菌降解特性将恶臭假单胞菌种子液按2%的接种量，接种到含有2g/L的香豆素培养基中，培养72h，温度30℃，摇床转速120rpm。同时做空白对照。每6h取样一次每次取样30mL，利用GC-MS测定发酵液中香豆素的含量。经过72h培养后，原1890.12mg/L的香豆素培养基中的香豆素残留浓度为52.61mg/L，对照为1890.12mg/L。四、样品测定前的准备取30mL发酵液，在10000r/min条件下对其进行离心10min，取20mLCH2Cl2，在分液漏斗中进行萃取，缓缓摇晃，使两相混合均匀，静置10min后，收集下层有机相，重复以上步骤3次，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，静置过夜，过滤，旋转蒸发除去CH2Cl2后，加入1mL色谱纯CH2Cl2溶解，过0.45μm有机系滤膜后，上GC-MS分析检测。降解菌的理化试验结果如图2所示，随着培养时间的推移香豆素的残留量逐渐降低，检测结果证明恶臭假单胞菌对香豆素的降解率为99.94%。如图3所示的GC-MS总离子流图，恶臭假单胞菌降解香豆素生成了二氢香豆素。以上所述仅为本专利技术的较佳实施例而已，并不用以限制本专利技术，凡在本专利技术的精神和原则之内，所作的任何修改本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一株降解香豆素的恶臭假单胞菌，其特征在于：所述恶臭假单胞菌已于2019年5月13日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17758。

【技术特征摘要】
1.一株降解香豆素的恶臭假单胞菌，其特征在于：所述恶臭假单胞菌已于2019年5月13日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.17758。2.根据权利要求1所述的降解香豆素的恶臭假单胞菌，其特征在于：所述恶臭假单胞菌菌体大小为0.6-0.8μm×1.5-2.0μm，呈细杆状，无鞭毛，在平板上为乳白色圆斑状，表面光亮，边缘整齐，不透明，中央隆起。3.权利要求1或2所述的恶臭假单胞菌的培养方法，其特征在于，步骤如下：将恶臭假单胞菌菌液按2%的接种量，接种到培养基中培养，培养条件为pH5-9，温度30℃，转速120rpm，培养12h。...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄申，毛多斌，韩丽，杨靖，杨峰，马宁，周利峰，魏涛，杨鹏飞，
申请(专利权)人：郑州轻工业学院，
类型：发明
国别省市：河南,41