一种关节软骨修复材料的制备方法-自体富血小板血浆结合透明质酸水凝胶技术

本发明专利技术涉及一种关节软骨修复材料的制备方法‑自体富血小板血浆结合透明质酸水凝胶，包括(1)透明质酸水凝胶的制备；(2)自体富血小板血浆的提取。本发明专利技术通过原位募集自体干细胞进行修复，从而避免了体外培养的细胞低存活率及低分化潜能的缺点。本发明专利技术将透明质酸水凝胶及富血小板血浆注射入缺损处，无需二期手术，从而实现软骨缺损修复。因而极大的提高其在临床的可推广性。

A preparation method of articular cartilage repair material-autologous platelet-rich plasma combined with hyaluronic acid hydrogel

【技术实现步骤摘要】
一种关节软骨修复材料的制备方法-自体富血小板血浆结合透明质酸水凝胶
本专利技术涉及医疗材料领域，具体涉及一种关节软骨修复材料的制备方法-自体富血小板血浆结合透明质酸水凝胶。
技术介绍
骨性关节炎是一种关节退变的疾病，随着国内人口老龄化的不断进展，因此骨性关节炎成为影响老年人生活质量的主要原因。由于目前临床上尚无有效的缓解骨性关节炎的方法，最终只能通过关节置换来缓解其导致的关节疼痛。但是大量的关节置换给家庭和社会带来了严重的经济负担，因而骨性关节炎是亟需解决的重大问题。软骨缺损是骨性关节炎的主要表现，目前临床上常用的治疗软骨缺损的方法主要包括微骨折，自体或异体骨软骨移植，软骨细胞移植，而这些方法均无法再生出天然的透明软骨，所修复的组织在成分及性能上明显低于天然软骨，因而只能在一定程度上缓解软骨退变。近年来，利用组织工程技术修复关节软骨缺损得到了很大的发展，例如利用软骨细胞体外培养形成软骨组织，随后植入软骨缺损处，或将软骨细胞与三维支架结合植入软骨缺损处进行修复。无论何种组织工程修复技术都离不开三要素，即支架、生长因子、种子细胞。其修复过程为支架可提供干细胞进行粘附，生长及分化的空间三维结构，生长因子可促进干细胞成软骨分化，并分泌软骨基质，沉积于三维支架中，随后支架逐渐降解，从而再生出天然软骨。下面将从这三方面阐明本专利技术中使用的方法较其他现有方法的优势。首先，目前常用的组织工程支架为PLA，PGA或胶原支架，这种支架产生的软骨成分主要是一型胶原，而天然透明软骨的主要成分为二型胶原，因为无法再生出天然软骨。本专利技术使用的为可注射透明质酸水凝胶支架，该支架具有的突出优势主要包括，1、局部注射入软骨缺损处，随后通过紫外点光源照射后即可固化，因此不受软骨缺损形状的限制；2.透明质酸为天然软骨中的固有成分，因而透明质酸水凝胶具有良好的生物相容性，并且具有良好的可降解性能。3、透明质酸水凝胶为含水量较高的支架，可模仿正常软骨的三维空间结构，从而为细胞的生长分化提供良好的微环境。生长因子可以促进干细胞向软骨方向分化，从而产生软骨相关基质。由于目前常用的生长因子为体外合成或异体生长因子，而这些生长因子具有一定的免疫原性，并且价格昂贵，从而限制其在体内的应用。本专利技术使用的是通过自体血液离心后获取的富血小板血浆，富血小板血浆中富含有多种生长因子，包括TGF-beta、VEGF、PDGF、IGF等，这些生长因子可促进干细胞向软骨方向分化。并且这些生长因子可持续从血小板中释放，从而在软骨缺损部位持续刺激软骨生成。软骨的修复离不开细胞的参与，软骨缺损后参与修复的细胞主要有骨髓来源的间充质干细胞，滑膜来源的干细胞或脂肪来源的干细胞。目前组织工程技术通过体外培养细胞，随后植入缺损部位，但是植入后的细胞存活率较低，尤其是离体后导致其分化潜能降低，从而导致修复能力有限。而本专利技术通过将透明质酸水凝胶及自体富血小板血浆注入软骨缺损部位，其中富血小板血浆释放的生长因子可募集自体干细胞迁移至缺损部位，随后在水凝胶支架中生长，在富血小板血浆释放的生长因子作用下向软骨细胞分化，从而修复缺损软骨。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种关节软骨修复材料的制备方法-自体富血小板血浆结合透明质酸水凝胶，通过原位募集自体干细胞进行修复，从而避免了体外培养的细胞低存活率及低分化潜能的缺点。为实现上述目的，本专利技术提供的技术方案是：一种关节软骨修复材料的制备方法-自体富血小板血浆结合透明质酸水凝胶，包括以下步骤：一、透明质酸水凝胶的制备：1)取适量透明质酸钠溶解在蒸馏水中，低温条件4-20度下，搅拌12h；2)向所得溶液中加入适量甲基丙酸烯酐，在pH为8-9，温度为4度的条件下反应24h；3)将所得产物在丙酮中沉淀，用乙醇洗净，溶解在去离子水中，去离子水透析48h后，得到修饰后的透明质酸钠；4)将修饰后的透明质酸钠按2％浓度溶解在蒸馏水中，按照0.1％浓度加入光引发剂，将液态水凝胶注入软骨缺损部位，紫外点光源照射下原位成胶，即可得到固化的透明质酸水凝胶；二、自体富血小板血浆的提取：1)将适量枸橼酸钠抗凝剂加入提取离心管中；2)在全血中加入预先混有枸橼酸钠抗凝剂的离心管中，充分混匀；3)进行第一次离心，离心速度为2400r/min，离心时间为10min；4)第一次离心后，血液分为三层，包括底层的血细胞、中层的白膜层、表层的血清，将底层的血细胞抽出；5)放入离心机中进行第二次离心，第二次离心后，同样分为三层，使用注射器将表层的血清层抽出，即可得到浓缩的富血小板血浆；6)将提取的浓缩富血小板血浆注入关节腔内，即可得到自体富血小板血浆结合透明质酸水凝胶软骨修复系统。所述光引发剂采用Irgacure2959。步骤一中，每100ml蒸馏水中溶解2g透明质酸钠，然后加入1.6ml的甲基丙酸烯酐。步骤一、4)中，紫外光强度为15μW/cm2，照射时间为30s。步骤二中，枸橼酸钠抗凝剂与全血的体积比为1：9。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：(1)安全有效，本专利技术使用的透明质酸水凝胶含水量较高，可充分模拟天然软骨的三维结构，从而为细胞提供了良好的细胞-细胞及细胞-细胞外基质相互作用的微环境，并且透明质酸具有促进干细胞成软骨分化潜能，且通过抑制细胞的伸展，从而有利于细胞分泌较多的二型胶原蛋白。透明质酸为天然软骨组成成分，降解产物无毒，因而具有良好的生物相容性。另外，本专利技术使用的为自体富血小板血浆，从而排除了外源生长因子导致的免疫原性问题，并且自体富血小板血浆富含有多种生长因子，从而可促进干细胞向软骨方向分化，极大的促进了软骨缺损的修复。(2)价格低廉，本专利技术可显著降低软骨修复成本，首先，透明质酸为一种价格低廉的材料，来源广泛，并且透明质酸水凝胶制备方法简单易操作；其次，自体富血小板血浆是通过自体血液离心后获取的成分，由于来源于患者本身，避免了使用外源性的生长因子，从而显著的降低了生长因子的获取成本。(3)简单易操作，目前常用的方法是通过较大的切口打开关节腔，将修复材料填入缺损部位，这种方法创伤较大且价格昂贵。本专利技术使用的是可注射透明质酸水凝胶，通过注射器将水凝胶注入缺损部位，随后在紫外点光源照射下即可原位固化，实现了创伤小、易操作的需求。并且自体富血小板血浆可通过市场上的富血小板血浆提取套装，参照步骤进行提取即可，操作简单易行。(4)一步法修复软骨缺损，目前常用的组织工程技术，无论是自体软骨细胞移植或基质诱导软骨细胞移植，均需要一期手术获取软骨组织，体外培养软骨细胞，随后二期手术植入体内，而这种操作无疑给患者带来更大的创伤。而本专利技术通过一步法将透明质酸水凝胶及富血小板血浆注射入缺损处，无需二期手术，从而实现软骨缺损修复。因而极大的提高其在临床的可推广性。附图说明图1：透明质酸水凝胶固化前呈液态。图2：透明质酸水凝胶固化后呈固态。图3：自体富血小板血浆的提取示意图。图4：标本修复大体观评估，显示实验组软骨缺损修复效果明显优于对照组。图5：标本修复HE染色评估，显示实验组软骨缺损修复效果明显优于对照组。图6：标本修复HE染色评估，显示实验组软骨缺损修复效果明显优于对照组。图7:标本修复二型胶原免疫组化染色评估，显示实验组软骨缺损修复效果明显优于对照组，实验组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种关节软骨修复材料的制备方法‑自体富血小板血浆结合透明质酸水凝胶，其特征在于：包括以下步骤：一、透明质酸水凝胶的制备：1)取适量透明质酸钠溶解在蒸馏水中，低温条件4‑20度下，搅拌12h；2)向所得溶液中加入适量甲基丙酸烯酐，在pH为8‑9，温度为4度的条件下反应24h；3)将所得产物在丙酮中沉淀，用乙醇洗净，溶解在去离子水中，去离子水透析48h后，得到修饰后的透明质酸钠；4)将修饰后的透明质酸钠按2％浓度溶解在蒸馏水中，按照0.1％浓度加入光引发剂，将液态水凝胶注入软骨缺损部位，紫外点光源照射下原位成胶，即可得到固化的透明质酸水凝胶；二、自体富血小板血浆的提取：1)将适量枸橼酸钠抗凝剂加入提取离心管中；2)在全血中加入预先混有枸橼酸钠抗凝剂的离心管中，充分混匀；3)进行第一次离心，离心速度为2400r/min，离心时间为10min；4)第一次离心后，血液分为三层，包括底层的血细胞、中层的白膜层、表层的血清，将底层的血细胞抽出；5)放入离心机中进行第二次离心，第二次离心后，同样分为三层，使用注射器将表层的血清层抽出，即可得到浓缩的富血小板血浆；6)将提取的浓缩富血小板血浆注入关节腔内，即可得到自体富血小板血浆结合透明质酸水凝胶软骨修复系统。...

【技术特征摘要】
1.一种关节软骨修复材料的制备方法-自体富血小板血浆结合透明质酸水凝胶，其特征在于：包括以下步骤：一、透明质酸水凝胶的制备：1)取适量透明质酸钠溶解在蒸馏水中，低温条件4-20度下，搅拌12h；2)向所得溶液中加入适量甲基丙酸烯酐，在pH为8-9，温度为4度的条件下反应24h；3)将所得产物在丙酮中沉淀，用乙醇洗净，溶解在去离子水中，去离子水透析48h后，得到修饰后的透明质酸钠；4)将修饰后的透明质酸钠按2％浓度溶解在蒸馏水中，按照0.1％浓度加入光引发剂，将液态水凝胶注入软骨缺损部位，紫外点光源照射下原位成胶，即可得到固化的透明质酸水凝胶；二、自体富血小板血浆的提取：1)将适量枸橼酸钠抗凝剂加入提取离心管中；2)在全血中加入预先混有枸橼酸钠抗凝剂的离心管中，充分混匀；3)进行第一次离心，离心速度为2400r/min，离心时间为10min；4)第一次离心后，血液分为三层，包括底层的血细胞、中层的白膜层、表层的血清，将底层的血细胞抽出；5)...

【专利技术属性】
技术研发人员：史冬泉，闫文强，蒋青，徐兴全，戴进，
申请(专利权)人：南京鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32