靶向肿瘤细胞的给药体系及其制备方法及应用技术

本发明专利技术提供一种靶向肿瘤细胞的给药体系及其制备方法及应用。所述给药体系是由硫辛酸‑甘氨酸‑苯丙氨酸‑亮氨酸‑甘氨酸‑阿霉素(简称LAX)修饰的金纳米棒。首先合成具有光热转化性能的金纳米棒，在其表面修饰LAX分子，得到AuNR‑LAX纳米药物传递体系。通过对乳腺癌细胞MCF‑7和MCF‑7/ADR耐药细胞的抗肿瘤活性评价，表明AuNR‑LAX具有抗肿瘤活性，且随着给药时间延长，对于敏感细胞和耐药细胞的抗肿瘤活性均增强，具有克服肿瘤细胞多药耐药的能力。与阿霉素相比AuNR‑LAX可降低其对正常细胞的损伤作用。

Drug Delivery System Targeting Tumor Cells and Its Preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
靶向肿瘤细胞的给药体系及其制备方法及应用
本专利技术涉及生物医药领域，具体地说，涉及一种靶向肿瘤细胞的给药体系及其制备方法及应用。
技术介绍
由于肿瘤的发生，人类的健康安全受到极大威胁，对肿瘤治疗的研究一直受到广泛关注。传统的肿瘤治疗方法有手术治疗，放射治疗，化学药物治疗等。其中，化学药物治疗即化疗，利用化学药物对肿瘤进行治疗，是临床上常用的重要手段之一。在化疗过程中，肿瘤细胞往往对化疗药物产生耐药性，严重影响了临床化疗的治疗效率，导致临床肿瘤化疗的失败。有调查发现大多数化疗患者治疗失败或术后复发是由耐药性导致的。此外，大多数抗肿瘤化疗的药物本身水溶性差，药物的选择性差，在抑制肿瘤生长的同时不可避免地对正常细胞产生损伤，引起一系列如脱发、食欲不振等不良反应。因此，研究克服肿瘤耐药问题以及减少抗肿瘤药物对正常细胞和组织的毒副作用对临床抗肿瘤治疗非常重要。目前克服化疗药物的耐药性和减少其毒副作用的重要策略之一就是寻找和开发新的药物载体材料并构建有效的靶向药物传递系统。阿霉素属于蒽环类抗生素，是一种高效广谱的化疗药物，对实体瘤和液体瘤都有比较好的抑瘤作用，已经广泛用于治疗肺癌、宫颈癌、肺癌、肝癌、白血病、淋巴癌等肿瘤，是临床上常用的一线化疗药物之一。但是，阿霉素的水溶性较差，在溶液中不稳定，口服生物利用度低，药代动力学不稳定。此外，蒽环类抗肿瘤抗生素长期使用易产生耐药性(multidrugresistance,MDR)。耐药性是指经过化疗后，癌细胞对结构相似的药物产生耐药性，也可以对其他结构不具有相似性的药物产生耐药性。此外，有些癌细胞本身就有耐药性。因此，阿霉素在临床应用过程中，较易产生耐药现象，这严重影响了阿霉素的临床治疗效果。同时，阿霉素在应用中还会产生严重的毒副作用，长期使用可发生剂量依赖的不可逆的心脏毒性、肝脏损害、大脑和肾脏损伤。因此，构建阿霉素的药物传递系统，促进药物在肿瘤组织的分布，增加药效并减少毒副作用，是十分必要的。金纳米棒由于其良好的物理化学性质一直受到广泛研究。通过对金纳米棒的表面修饰，可以使其表面的范德华力和静电作用保持相对平衡，提高其稳定性。金纳米棒独特的光学性质和光热效应，也是研究的热点。已有研究表明，金纳米棒生物相容性良好，目前有一些金的纳米药物已进入临床研究阶段，说明其对人体没有明显的毒副作用。金纳米棒是一种具有潜力的多功能药物载体材料。金纳米棒的光学性质主要源于其表面等离子体共振的现象。金表面有很多自由电子，这些电子的集体激发即为等离子体，受到光照射时，当入射光子的频率和等离子体振动频率相当时，就会发生等离子共振的现象。等离子体共振现象可使光学性质显著增强，如在可见光及近红外波段具有强吸收，这些性质对于构建多功能的纳米药物传递系统具有重要意义。不仅可以利用其表面易于修饰的性质进行载药，结合药物的化学治疗和金纳米棒的光热效应可以提高纳米传递系统的抗肿瘤活性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种靶向肿瘤细胞的给药体系及其制备方法及应用。为了实现本专利技术目的，专利技术人预先设计出一种新的多肽和阿霉素的偶联化合物，命名为LAX，其以GFLG(甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸)为连接臂，一端修饰了易于与金连接的硫辛酸，一端连接有阿霉素(图1)。其中，硫辛酸通过其巯基和金的配位键键合，从而与金颗粒表面连接。硫辛酸通过酰胺键与甘氨酸的氨基连接。阿霉素通过酰胺键与甘氨酸的羧基连接。其结构中含有的GFLG多肽具有肿瘤细胞内酶响应的特点。GFLG是由甘氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸，甘氨酸通过酰胺键连接形成的小分子四肽化合物。研究发现，多种肿瘤细胞的溶酶体中高表达组织蛋白酶B，而在正常细胞中组织蛋白酶B低表达。更重要的是，GFLG可被组织蛋白酶B特异性地识别并水解，是一个具有良好应用前景的酶响应的小分子化合物，可作为药物与载体的连接臂。当偶联物进入肿瘤细胞，它可被肿瘤细胞溶酶体内高表达的组织蛋白酶B识别并水解，释放出其连接的药物，实现药物的可控释放，提高药物传递系统对肿瘤细胞的杀伤能力。同时，也可以减少药物在正常细胞的释放，从而减轻对正常细胞的损伤。第一方面，本专利技术提供一种靶向肿瘤细胞的给药体系的制备方法，所述给药体系是由硫辛酸-甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸-阿霉素(简称LAX)修饰的金纳米棒。制备方法包括以下步骤：A、LAX二甲基甲酰胺溶液的制备，其中所述LAX为硫辛酸-甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸-阿霉素按照多肽合成的常规方法合成甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸，然后进行酰胺化反应，使甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸通过多肽C端甘氨酸上的羧基与阿霉素连接，使甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸通过多肽N端甘氨酸上的氨基与硫辛酸连接，得到LAX；将LAX溶于二甲基甲酰胺中，配制成0.09mM的LAX二甲基甲酰胺溶液；B、金纳米棒的制备b1、种子液的制备：室温搅拌下，将0.01MHAuCl40.2～0.5mL和0.1MCTAB0.5～12.5mL混合，然后加入0.01MNaBH4水溶液0.2～1.2mL，继续搅拌(2min)，室温静置，即得种子液；b2、室温搅拌下，将0.01MHAuCl41.5～2.5mL和0.1MCTAB40mL混合，然后加入0.01M硝酸银水溶液0.2～1.0mL和0.1M抗坏血酸水溶液0.2～1.5mL，待溶液反应至无色，向其中加入b1所得种子液0.42mL，继续搅拌(2min)，30℃静置过夜，10000rpm转速下离心15min收集沉淀，即得金纳米棒；C、AuNR-PEG的制备c1、PEG-SH水溶液的制备，其中PEG-SH的分子量为1000Da：将PEG-SH溶于水中，配制成4.0mM的PEG-SH水溶液；c2、将步骤B所得金纳米棒加水重新分散，配制成10nM的AuNR溶液，将1mLAuNR溶液与4.0mMPEG-SH水溶液25μL混合，室温搅拌反应24～36h，反应结束后，8000rpm转速下离心15min收集沉淀，即得AuNR-PEG；D、靶向肿瘤细胞的给药体系的制备将步骤C所得AuNR-PEG加水重新分散，配制成0.06nM的AuNR-PEG水溶液，向10.7mLAuNR-PEG水溶液中加入步骤A0.09mM的LAX二甲基甲酰胺溶液350μL，室温搅拌反应24～36h，反应结束后，8000rpm转速下离心15min收集沉淀，即为靶向肿瘤细胞的给药体系，命名为AuNR-LAX。在本专利技术的一个具体实施方式中，AuNR-LAX给药体系的制备如下：1、LAX二甲基甲酰胺溶液的制备按照多肽合成的常规方法合成甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸，然后进行酰胺化反应，使甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸通过多肽C端甘氨酸上的羧基与阿霉素连接，使甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸通过多肽N端甘氨酸上的氨基与硫辛酸连接，得到LAX；将0.34mgLAX溶于3.4mL二甲基甲酰胺中，配制成0.09mM的LAX二甲基甲酰胺溶液。2、金纳米棒(AuNR)的制备2.1种子液的制备：室温搅拌下，将0.01MHAuCl40.25mL和0.1MCTAB7.5mL混合，然后加入0.01MNaBH4水溶液0.6mL，继续搅拌2min，然后停止搅拌，室温静置，即得种子液。2.2室温搅拌下，将0.01MH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.靶向肿瘤细胞的给药体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A、LAX二甲基甲酰胺溶液的制备，其中所述LAX为硫辛酸‑甘氨酸‑苯丙氨酸‑亮氨酸‑甘氨酸‑阿霉素；按照多肽合成的常规方法合成甘氨酸‑苯丙氨酸‑亮氨酸‑甘氨酸，然后进行酰胺化反应，使甘氨酸‑苯丙氨酸‑亮氨酸‑甘氨酸通过多肽C端甘氨酸上的羧基与阿霉素连接，使甘氨酸‑苯丙氨酸‑亮氨酸‑甘氨酸通过多肽N端甘氨酸上的氨基与硫辛酸连接，得到LAX；将LAX溶于二甲基甲酰胺中，配制成0.09mM的LAX二甲基甲酰胺溶液；B、金纳米棒的制备b1、种子液的制备：室温搅拌下，将0.01M HAuCl4 0.2～0.5mL和0.1M CTAB 0.5～12.5mL混合，然后加入0.01M NaBH4水溶液0.2～1.2mL，继续搅拌，室温静置，即得种子液；b2、室温搅拌下，将0.01M HAuCl4 1.5～2.5mL和0.1M CTAB 40mL混合，然后加入0.01M硝酸银水溶液0.2～1.0mL和0.1M抗坏血酸水溶液0.2～1.5mL，待溶液反应至无色，向其中加入b1所得种子液0.42mL，继续搅拌，30℃静置过夜，10000rpm转速下离心15min收集沉淀，即得金纳米棒；C、AuNR‑PEG的制备c1、PEG‑SH水溶液的制备，其中PEG‑SH的分子量为1000Da：将PEG‑SH溶于水中，配制成4.0mM的PEG‑SH水溶液；c2、将步骤B所得金纳米棒加水重新分散，配制成10nM的AuNR溶液，将1mL AuNR溶液与4.0mM PEG‑SH水溶液25μL混合，室温搅拌反应24～36h，反应结束后，8000rpm转速下离心15min收集沉淀，即得AuNR‑PEG；D、靶向肿瘤细胞的给药体系的制备将步骤C所得AuNR‑PEG加水重新分散，配制成0.06nM的AuNR‑PEG水溶液，向10.7mL AuNR‑PEG水溶液中加入步骤A 0.09mM的LAX二甲基甲酰胺溶液350μL，室温搅拌反应24～36h，反应结束后，8000rpm转速下离心15min收集沉淀，即为靶向肿瘤细胞的给药体系。...

【技术特征摘要】
1.靶向肿瘤细胞的给药体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A、LAX二甲基甲酰胺溶液的制备，其中所述LAX为硫辛酸-甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸-阿霉素；按照多肽合成的常规方法合成甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸，然后进行酰胺化反应，使甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸通过多肽C端甘氨酸上的羧基与阿霉素连接，使甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸通过多肽N端甘氨酸上的氨基与硫辛酸连接，得到LAX；将LAX溶于二甲基甲酰胺中，配制成0.09mM的LAX二甲基甲酰胺溶液；B、金纳米棒的制备b1、种子液的制备：室温搅拌下，将0.01MHAuCl40.2～0.5mL和0.1MCTAB0.5～12.5mL混合，然后加入0.01MNaBH4水溶液0.2～1.2mL，继续搅拌，室温静置，即得种子液；b2、室温搅拌下，将0.01MHAuCl41.5～2.5mL和0.1MCTAB40mL混合，然后加入0.01M硝酸银水溶液0.2～1.0mL和0.1M抗坏血酸水溶液0.2～1.5mL，待溶液反应至无色，向其中加入b1所得种子液0.42mL，继续搅拌，30℃静置过夜，10000rpm转速下离心15min收集沉淀，即得金纳米棒；C、AuNR-PEG的制备c1、PEG-SH水溶液的制备，其中PEG-SH的分子量为1000Da：将PEG-SH溶于水中，配制成4.0mM的PEG-SH水溶液；c2、将步骤B所得金纳米棒加水重新分散...

【专利技术属性】
技术研发人员：房晨婕，支晓敏，钱迪，
申请(专利权)人：首都医科大学，
类型：发明
国别省市：北京,11