人工组织前体及制备其的方法技术

本发明专利技术涉及组织工程领域和3D打印领域，具体涉及一种人工组织前体及制备其的方法。具体而言，本发明专利技术涉及一种人工组织前体，其包含固体支持物和多个微囊，其中，至少一个微囊与固体支持物贴合，所述微囊包含细胞和包裹细胞的生物相容性材料；制备所述人工组织前体的方法；用于制备人工组织前体的试剂盒和套盒；由所述人工组织前体培养得到的人工组织，例如人工管腔；包含所述人工组织前体或人工管腔的管腔植入体或管腔模型；人工组织前体用于制备人工组织、管腔植入体或管腔模型的用途；以及，人工组织用于制备管腔植入体或管腔模型的用途。

Artificial tissue precursors and their preparation methods

【技术实现步骤摘要】
人工组织前体及制备其的方法本申请为国际申请PCT/CN2017/101738于2018年3月29日进入中国国家阶段、申请号201780003356.2、专利技术名称为“人工组织前体及制备其的方法”的申请的分案申请。
本专利技术涉及组织工程领域和3D打印领域。具体而言，本专利技术涉及一种人工组织前体，其包含固体支持物和多个微囊，其中，至少一个微囊与固体支持物贴合，所述微囊包含细胞和包裹细胞的生物相容性材料；制备所述人工组织前体的方法；用于制备人工组织前体的试剂盒和套盒；由所述人工组织前体培养得到的人工组织，例如人工管腔；包含所述人工组织前体或人工管腔的管腔植入体或管腔模型；人工组织前体用于制备人工组织、管腔植入体或管腔模型的用途；以及，人工组织用于制备管腔植入体或管腔模型的用途。
技术介绍
血管移植术和血管补片修补术可用于对狭窄、闭塞、扩张、损伤或畸形的血管进行替换、重建或修补。常见的血管移植物或血管补片的来源为患者自体的动脉或静脉，但是，在患者自体的脉管供给不足的情况下(例如患者患有脉管疾病或先前已实施过血管移植术)，需要使用人工血管(补片)或异源血管(补片)作为替代物。人工血管的研制开始于20世纪初，用于制造人工血管的材料包括金属、玻璃、聚乙烯、硅橡胶等。大量动物实验发现，这些材料制备的人工血管在短期内会出现腔内血栓，因此无法用于临床。1952年，Voorhees将用维尼纶制造的人工血管应用到动物试验中并获得成功(参见VoorheesABJr,JaretzkiA3rd,BlakemoreAH.TheuseoftubesconstructedfromVinyon“N”clothinbridgingarterialdefects.J.AnnalsofSurgery,1952,135(3):332-336)。20世纪50-70年代，管壁带有网孔的人工血管陆续出现，采用的材料包括涤纶、真丝、膨体聚四氟乙烯等。但是，单纯通过材料的改进还无法解决由血栓和新生内膜增厚所引起的血管再狭窄或堵塞的问题。研究人员进一步尝试了优化人工血管的材料，包括：从1980年开始对人工血管内表面添加材料涂层，如碳涂层、纳米颗粒涂层、蛋白涂层等；从1982年开始使用复合型材料制备人工血管；从1984年开始对人工血管内表面进行材料的改性，如材料内添加肝素或尿激酶等抗凝剂，对内壁材料磺酸化、等离子体化；从1992年开始研发新型生物相容性抗凝材料，如聚氨酯；从1998年开始使用天然生物材料，如脱细胞血管基质材料支架。这些方法在一定程度上确实对人工血管的性能有所改善，但这些人工血管植入体内后，依然会出现血栓和再狭窄的情况，无法达到与正常血管一致的功能。相关文献也报道了这些现象，例如MacLeodDC,StraussBH,deJongM,EscanedJ,UmansVA,vanSuylenRJ,VerkerkA,deFeyterPJ,SerruysPW.Proliferationandextracellularmatrixsynthesisofsmoothmusclecellsculturedfromhumancoronaryatheroscleroticandrestenoticlesions.JAmCollCardiol.1994,23(1):59-65；以及BaumgartnerI,SchainfeldR,GrazianiL.ManagementofPeripheralVascularDisease.AnnualReviewofMedicine.2005,56(1):249-272。正常的血管之所以不出现血栓，是因为其管腔内壁有一层内皮细胞层。因此，要想人工血管达到和正常血管一样的功能，最根本的解决办法就是使人工血管内皮化，也就是在人工血管的内壁表面形成一层完整的内皮细胞层。1978年，Herring等人首先报道了使用自体内皮细胞种植技术对人工血管进行内皮化的实验研究(参见HerringM,GardnerA,GloverJ.Asingle-stagedtechniqueforseedingvasculargraftswithautogenousendothelium.Surgery.1978,84(4):498-504)。该技术将自体来源的内皮细胞在体外培养扩增后，直接种植到人工血管内壁表面，希望经过体外短时间培养并植入体内后，这些内皮细胞能够形成完整的内皮细胞层。该研究为临床内皮细胞种植研究开创了先河。但是，内皮细胞体外培养生长缓慢，难以获得足够数量的细胞，且传代5-8代后迅速发生衰老，直接影响细胞种植后的功能体现。大量的体内外实验证明，这种将内皮细胞直接种植在人工血管内壁的方法，细胞抗血流冲击能力弱，容易脱落，无法形成内皮细胞层，与没有种植内皮细胞的人工血管相比，在抗血栓方面没有明显差异(参见HerringM,SmithJ,DalsingM,GloverJ,ComptonR,EtchbergerK,ZollingerT.Endothelialseedingofpolytetrafluoroethylenefemoralpoplitealbypasses:thefailureoflow-densityseedingtoimprovepatency.JVascSurg,1994；20(4):650-655；以及JensenN,LindbladB,BergqvistD.Endothelialcellseededdacronaortobifurcatedgrafts:plateletdepositionandlong-termfollow-up.JCardiovascSurg(Torino),1994；35(5):425-429)。1986年，研究人员开始了组织工程血管的研究，随后将干细胞作为种子细胞进行人工血管的构建。干细胞的来源主要包括胚胎干细胞、造血干细胞、间充质干细胞和诱导性多能干细胞(IPS)。将干细胞作为种子细胞构建人工血管的方法包括：制造血管支架材料，将干细胞在体外诱导为血管细胞(包括内皮细胞，平滑肌细胞和成纤维细胞)后，种植在支架材料中，进行体内植入；或者直接将干细胞种植到血管支架材料中。后者的具体过程是：先制备血管支架，再将培养好的种子细胞以细胞悬液的方式滴加在血管支架表面，经过体外培养，使细胞粘附在支架表面，再植入体内。细胞要进入支架内部，需要经过迁移过程。因此，这两种方法制造的人工血管往往在支架表面有大量的细胞聚集，而内部只有很少量的细胞存在，或者细胞分布不均匀，从而使制造的人工血管难以形成完整的结构和功能。如果是多种细胞种植在支架中，更会出现细胞分布紊乱的现象。因此，使用这两种方法制造的人工血管，其内部血管细胞排列紊乱，难以形成完整的内皮细胞层以及结构规整的平滑肌细胞层，依然无法应用于临床。专利技术概述为了解决上述技术问题，本申请专利技术人开发了新的用于制备人工组织前体的方法。在某些优选的实施方案中，所述人工组织前体是人工管腔前体，其可以形成人工管腔(例如人工血管)。在一个方面，本专利技术涉及一种人工组织前体，其包含固体支持物和多个微囊，其中，至少一个微囊与固体支持物贴合，所述微囊包含细胞和包裹细胞的生物相容性材料。在某些优本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人工组织前体，其包含片状固体支持物和多个微囊，其中，至少一个微囊与所述固体支持物贴合；所述微囊具有0.01‑0.04GPa的硬度，和，具有0.01‑0.1MPa的弹性模量；所述微囊包含细胞和包裹所述细胞的核层，还包含1层、2层或3层封装所述核层的壳层，并且核层和各个壳层各自独立地由生物可降解材料制成；所述壳层的厚度各自独立地为2‑20μm；用于制备核层的所述生物可降解材料选自：壳聚糖、胶原蛋白、海藻酸钠、明胶以及其任意组合；用于制备壳层的所述生物可降解材料选自：明胶、胶原蛋白、透明质酸、聚赖氨酸、纤维蛋白以及其任意组合；所述人工组织前体为片状；所述固体支持物由生物相容性材料制得，所述生物相容性材料包含生物不可降解材料；优选地，所述人工组织前体为管腔(例如循环管腔、消化管腔、呼吸管腔、泌尿管腔或生殖管腔)前体；优选地，所述管腔为包含上皮细胞的管腔(例如血管，食管，气管，胃，胆管，肠道(包括小肠和大肠，例如十二指肠、空肠、回肠、盲肠(包括阑尾)、升结肠、结肠右曲、横结肠、结肠左曲、降结肠、乙状结肠、直肠)，输卵管，输精管，输尿管，膀胱或淋巴管)；优选地，多个所述微囊构成一个或多个生物构建体；优选地，一个或多个生物构建体与固体支持物贴合。...

【技术特征摘要】
2016.09.14 CN 2016108210505;2016.09.14 CN 201610821.一种人工组织前体，其包含片状固体支持物和多个微囊，其中，至少一个微囊与所述固体支持物贴合；所述微囊具有0.01-0.04GPa的硬度，和，具有0.01-0.1MPa的弹性模量；所述微囊包含细胞和包裹所述细胞的核层，还包含1层、2层或3层封装所述核层的壳层，并且核层和各个壳层各自独立地由生物可降解材料制成；所述壳层的厚度各自独立地为2-20μm；用于制备核层的所述生物可降解材料选自：壳聚糖、胶原蛋白、海藻酸钠、明胶以及其任意组合；用于制备壳层的所述生物可降解材料选自：明胶、胶原蛋白、透明质酸、聚赖氨酸、纤维蛋白以及其任意组合；所述人工组织前体为片状；所述固体支持物由生物相容性材料制得，所述生物相容性材料包含生物不可降解材料；优选地，所述人工组织前体为管腔(例如循环管腔、消化管腔、呼吸管腔、泌尿管腔或生殖管腔)前体；优选地，所述管腔为包含上皮细胞的管腔(例如血管，食管，气管，胃，胆管，肠道(包括小肠和大肠，例如十二指肠、空肠、回肠、盲肠(包括阑尾)、升结肠、结肠右曲、横结肠、结肠左曲、降结肠、乙状结肠、直肠)，输卵管，输精管，输尿管，膀胱或淋巴管)；优选地，多个所述微囊构成一个或多个生物构建体；优选地，一个或多个生物构建体与固体支持物贴合。2.权利要求1的人工组织前体，所述微囊为生物砖；优选地，所述微囊的尺寸各自独立地为20-2000μm，例如30-1900μm，40-1800μm，50-1700μm，60-1600μm，70-1500μm，80-1400μm，90-1300μm，100-1200μm，200-1000μm，300-800μm，400-600μm，100-500μm；优选地，所述微囊各自独立地为球形，或者任何期望的形状(例如立方体，矩形棱柱，六棱柱，圆柱，或不规则的形状)；优选地，所述微囊各自独立地为固体或半固体，例如凝胶态。3.权利要求1或2的人工组织前体，所述微囊中包含上皮细胞，例如内皮细胞(例如血管内皮细胞)、平滑肌细胞(例如血管平滑肌细胞)和/或未分化的细胞；优选地，所述微囊中的细胞为未分化的细胞，例如干细胞(例如脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、诱导多能干细胞和胚胎干细胞)；优选地，所述未分化的细胞能够分化为上皮细胞(例如内皮细胞)和/或平滑肌细胞；优选地，所述未分化的细胞选自干细胞(例如脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、诱导多能干细胞和胚胎干细胞)和祖细胞(例如内皮祖细胞)中的一种或多种；优选地，所述细胞获自动物，例如哺乳动物，例如人、猿、猴、大猩猩、牛、猪、犬、绵羊和山羊；优选地，所述细胞来源于选自下述的组织：结缔组织(例如，疏松结缔组织、致密结缔组织、弹性组织、网状结缔组织和脂肪组织)、肌肉组织(例如，骨骼肌、平滑肌和心肌)、泌尿生殖组织、胃肠组织、肺组织、骨组织、神经组织和上皮组织(例如，单层上皮和复层上皮)、内胚层来源的组织、中胚层来源的组织和外胚层来源的组织；优选地，所述微囊各自独立地包含一个或多个细胞，例如1-106个细胞，例如10-900、20-800、30-700、40-600、50-500、60-400、70-300、80-200、10-100个、10-103个、10-104个、10-105个、10-106个细胞。4.权利要求1-3任一项的人工组织前体，其中，用于制备核层的所述生物可降解材料为胶原蛋白；优选地，所述壳层和/或核层是经过处理的(例如，使用壳层固定液或核层固定液进行了处理，例如以改善壳层和/或核层的力学性能)；优选地，所述壳层为通透性的；例如，所述壳层对于水，氧气，和营养物质(糖类例如葡萄糖，脂肪，蛋白质，氨基酸，短肽，矿物质，维生素、细胞因子、核苷酸)是通透性的；优选地，所述壳层具有用于微囊内外物质交换的通道或孔；优选地，所述壳层的厚度为2-5、5-10、10-15、15-20、10-20或5-20μm；优选地，所述微囊的核层或微囊的壳层各自独立地具有0.01-0.04GPa的硬度；优选地，所述微囊的核层或微囊的壳层各自独立地具有0.01-0.1MPa的弹性模量。5.权利要求1-4任一项的人工组织前体，其中，所述微囊还包含额外的试剂，例如，营养物质、细胞外基质、细胞因子和/或药物活性成分；优选地，所述额外的试剂能够调控(例如促进)细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢，或维持细胞的干性；优选地，所述营养物质包括但不限于，微量元素，核苷酸，氨基酸，多肽，碳水化合物(例如单糖，寡糖，多糖)，脂质，维生素；优选地，细胞外基质选自多糖，例如糖胺聚糖、蛋白聚糖；结构蛋白，例如胶原和弹性蛋白；粘着蛋白，例如纤粘连蛋白和层粘连蛋白；优选地，所述细胞因子是用于调控细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的细胞因子，包括但不限于：诱导未分化的细胞向平滑肌细胞或内皮细胞分化的细胞因子，例如TGF-α1、PDGF-BB、VEGF或b-FGF；优选地，所述药物活性成分为能够调控(例如促进)细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的试剂，或者为能够维持细胞干性的试剂；优选地，所述药物活性成分选自rhIL-2、rhIL-11、rhEPO、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、rHuEPO、sTNF-R1、和rhTNF-α。6.权利要求1-5任一项的人工组织前体，所述生物相容性材料还包含生物可降解材料。7.权利要求1-6任一项的人工组织前体，所述生物不可降解材料选自尼龙，涤纶，聚丙烯，聚乙烯，聚四氟乙烯，硅橡胶，氟硅橡胶，天然橡胶，聚丙烯酸酯，芳香族聚酯(例如聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET))，非降解性聚氨酯，聚醚醚酮，聚丙烯腈，聚硅氧烷，聚甲醛，聚氯乙烯，以及其任何组合；优选地，所述生物不可降解材料是生物惰性的；优选地，所述固体支持物在生物构建体的表面制得；优选地，所述固体支持物通过静电纺丝、挤压锻造、3D打印或喷涂制得。8.权利要求1-7任一项的人工组织前体，所述人工组织前体为片状，所述固体支持物为片状固体支持物，多个所述微囊构成一个或多个片状生物构建体，并且至少一个片状生物构建体与片状固体支持物贴合；优选地，所述片状固体支持物为平面的片状或者弯曲的片状；优选地，所述片状生物构建体为平面的片状或者弯曲的片状；优选地，所述人工组织前体包含片状固体支持物和一个片状生物构建体，所述片状生物构建体的一面与片状固体支持物的一面贴合；优选地，所述人工组织前体包含片状固体支持物和多个片状生物构建体，多个所述片状生物构建体位于片状固体支持物的一侧，并且各个片状生物构建体的一面均与片状固体支持物的一面贴合；优选地，所述人工组织前体包含片状固体支持物和多个片状生物构建体，多个所述片状生物构建体在片状固体支持物的一侧层叠排布，并且至少一个片状生物构建体的一面与片状固体支持物的一面贴合。9.权利要求8的人工组织前体，所述人工组织前体为圆形片状、椭圆形片状、平行四边形(例如矩形)片状、扇形片状或不规则片状；优选地，所述人工组织前体的厚度为0.5mm-3mm；优选地，所述人工组织前体的面积为0.5cm2-5cm2；优选地，所述人工组织前体具有均一或不均一的厚度；优选地，所述片状固体支持物为圆形片状、椭圆形片状、平行四边形(例如矩形)片状、扇形片状或不规则片状；优选地，所述片状固体支持物的厚度为0.5mm-3mm；优选地，所述片状固体支持物的面积为0.5cm2-5cm2；优选地，所述片状生物构建体为圆形片状、椭圆形片状、平行四边形(例如矩形)片状、扇形片状或不规则片状；优选地，所述片状生物构建体的厚度为20μm-3mm；优选地，所述片状生物构建体的面积为0.5cm2-5cm2。10.权利要求1-9任一项的人工组织前体，其中，至少一个微囊或者至少一个生物构建体与所述固体支持物固定在一起；优选地，至少一个微囊或者至少一个生物构建体与所述固体支持物通过化学方式贴合；优选地，至少一个生物构建体与所述固体支持物通过粘合剂粘合；更优选地，所述粘合剂为医用胶；优选地，所述医用胶选自：软组织类医用粘合剂和硬组织类医用粘合剂(例如，用于牙科或骨科的医用粘合剂)；优选地，所述医用胶选自：以2-氰基丙烯酸辛酯为主体的组织粘合剂、纤维蛋白粘合剂、合成树脂粘合剂(例如甲基丙烯酸酯系粘合剂或聚羧酸系粘合剂)、骨粘固剂或以聚甲基丙烯酸甲酯为主体的粘合剂)；优选地，所述医用胶包含α-氰基丙烯酸酯(例如α-氰基丙烯酸甲酯，α-氰基丙烯酸乙酯，α-氰基丙烯酸异丁酯，α-氰基丙烯酸异己酯，α-氰基丙烯酸辛酯，例如α-氰基丙烯酸正辛酯)。11.制备权利要求1-10任一项的人工组织前体的方法，其包含以下步骤：(I)制备片状(例如平面的片状或弯曲的片状)生物构建体；(II)将片状生物构建体与片状固体支持物进行贴合；优选地，制备片状生物构建体通过包含以下步骤的方法进行：(1)提供一种或多种微囊，其全部或者部分表面附着有第一组分；优选地，所述第一组分包含于第一试剂中；(2)在临时支持物表面的预设区域上涂布含有第二组分的第二试剂，其中，当所述第一组分与第二组分接触时，能够产生粘连效果，实现粘合作用；所述临时支持物具有至少一个平面，所述预设的图案位于临时支持物的平面；(3)将步骤(1)中的全部或者部分表面附着有第一组分的微囊放置于涂布了第二试剂的预设区域，使所述微囊表面上的第一组分与预设区域上的第二组分接触，产生粘连效果，从而将所述微囊组装(粘合)成第一层结构，所述第一层结构为平面的片状结构；任选地，所述方法还包括以下步骤：(4)在前一步骤产生的结构上涂布第二试剂；(5)将步骤(1)中的全部或者部分表面附着有第一组分的微囊放置于前一步骤产生的结构上，使所述微囊表面上的第一组分与前一步骤产生的结构上的第二组分接触，产生粘连效果，从而在前一步骤产生的结构上，将所述微囊组装(粘合)成另一层结构；(6)任选地，重复步骤(4)和(5)一次或多次，得到平面的片状生物构建体；任选地，所述方法还包括，对平面的片状生物构建体进行弯折，得到弯曲的片状生物构建体；优选地，所述预设区域为平行四边形(例如矩形)区域、圆形区域或椭圆形区域、扇形区域或不规则区域；优选地，所述临时支持物为3D打印机的打印平台；优选地，步骤(3)中，在将全部或部分表面附着有第一组分的微囊放置于步骤(2)的涂布了第二试剂的预设区域之后，静置0.1-60s；优选地，使用3D生物打印机来制备片状生物构建体。12.制备权利要求1-10任一项的人工组织前体的方法，其包含以下步骤：(I)由权利要求11定义的制备片状生物构建体的方法，制备片状生物构建体；(II)提...

【专利技术属性】
技术研发人员：康裕建，左潇，杜明春，
申请(专利权)人：四川蓝光英诺生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51