本发明专利技术公开了一种视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2，为pH为7.0～8.0的缓冲体系，包含有：视黄醇结合蛋白单克隆抗体包被的羧基化聚苯乙烯胶乳溶液：400～600mL/L和恢复液，恢复液包含稳定剂、表面活性剂和电解质，稳定剂为5～10g/L，表面活性剂为2～5g/L，电解质为5～15g/L；恢复液中各组分的含量是指占整个缓冲体系的含量。胶乳溶液由羧基化聚苯乙烯胶乳微球经EDC活化后偶联视黄醇结合蛋白单克隆抗体，并由PAMAM维持偶联效率，最后经封闭剂封闭反应得到。还提供上述视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2的具体制备方法及视黄醇结合蛋白胶乳试剂盒。本发明专利技术的视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2，偶联效率高且分散性好，检测灵敏度高、准确性好。本发明专利技术的制备方法，生产效率提高且成本降低。
Retinol binding protein latex reagent R2 and its preparation method and kit
【技术实现步骤摘要】
视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2及其制备方法和试剂盒
本专利技术属于视黄醇结合蛋白胶乳试剂合成
，尤指一种视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2及其制备方法和应用视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2的试剂盒。
技术介绍
视黄醇结合蛋白是由肝脏合成的维生素转运蛋白，属于Lipocalin蛋白超家族成员，广泛分布于血液、脑脊液、尿液及其他体液中。视黄醇结合蛋白的测定有利于发现早期的肾小管以及肾近曲小管的损害程度，且能作为肝功能早期损害和监护治疗指标。视黄醇结合蛋白检测试剂盒用于体外检测人血清中视黄醇结合蛋白的含量，包括试剂R1和试剂R2。试剂R1主要包括缓冲液，聚乙二醇、乙二胺四乙酸二钠等。缓冲液通常为磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液。目前检测视黄醇结合蛋白的方法主要有酶联免疫法、放射免疫测定法、胶乳免疫比浊法等。其中胶乳免疫比浊法采用视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2，因其具有较高的灵敏度、良好的特异性、较宽的线性范围受到了广泛的关注。但目前市场上大部分制备视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2的胶乳免疫比浊法为一步法或两步法。两步法在制备的过程中，需要对缓冲体系进行两次离心分离和分散，导致操作繁琐，且对于生产人员的操作要求较高，不仅影响生产效率，导致生产成本高，且质量无法统一，质量稳定性欠佳；同时制备的胶乳试剂通常存在偶联效率低，容易聚沉，检测灵敏度、准确性均欠佳的缺点，故而越来越多的生产企业倾向于一步法制备胶乳试剂。然而，一步法虽然在一定程度上较少了离心分离和分散的步骤，但依然需要在最后对缓冲体系进行离心吹打，且仍然存在生产效率低，生产成本高，且质量稳定性欠佳，制备的胶乳试剂通常存在偶联效率低，容易聚沉，检测灵敏度、准确性均欠佳的缺点。因此，有必要研发新的视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2及其制备方法，以克服现有技术中的上述技术缺陷。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2，其偶联效率高，分散性好，可有效避免聚沉，且检测灵敏度高，准确性好。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2，所述视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2为pH为7.0～8.0的缓冲体系，所述缓冲体系包含有：视黄醇结合蛋白单克隆抗体包被的羧基化聚苯乙烯胶乳溶液和恢复液，所述胶乳溶液在整个缓冲体系中的含量为400～600mL/L，其中：所述恢复液包含稳定剂、表面活性剂和电解质，所述稳定剂的含量为5～10g/L，表面活性剂的含量为2～5g/L，电解质的含量为5～15g/L；所述恢复液中各组分的含量是指占整个缓冲体系的含量；所述胶乳溶液为pH为5.0～6.0的缓冲溶液，包括：粒径为50～200nm的羧基化聚苯乙烯胶乳微球、活化用的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)、偶联加速用的聚酰胺-胺树枝状高分子(PAMAM)和封闭剂；所述羧基化聚苯乙烯胶乳微球的含量为10～15g/L，所述EDC的含量为0.5～1g/L，所述PAMAM的含量为1～4g/L，所述封闭剂的含量为2.5～5g/L；所述胶乳溶液中各组分的含量是指占整个胶乳溶液的含量；所述胶乳溶液由羧基化聚苯乙烯胶乳微球经EDC活化后偶联视黄醇结合蛋白单克隆抗体，并由PAMAM维持偶联效率，最后经封闭剂封闭反应得到。优选地，所述恢复液在整个缓冲体系中的含量为400～600mL/L。优选地，所述恢复液，还包括防腐剂，所述防腐剂在所述缓冲体系中的浓度为0.5～5g/L。优选地，所述恢复液还包括表面活性剂PAMAM，以提高胶乳的分散稳定性，从而减少试剂R2的聚沉，使得试剂R2在检测视黄醇结合蛋白的过程中，抗体与检测样本中的抗原反应的几率进一步增加，因此进一步提高检测灵敏度和准确性。进一步优选地，作为表面活性剂的PAMAM在所述缓冲体系中的浓度为0.5～5g/L。优选地，所述视黄醇结合蛋白单克隆抗体在所述缓冲体系中的浓度为0.2～0.5g/L。优选地，所述封闭剂可以选自牛血清蛋白(BSA)溶液、CE210和CE510中的一种或几种。所述的CE210和CE510购买自生产商SRLifeSciences。所述表面活性剂可以选自聚氧乙烯月桂醚和PAMAM溶液中的一种或两种；本领域技术人员很容易理解，所述稳定剂可以选自BSA溶液、氯化胆碱、d-甘露糖醇中的一种或几种；优选为BSA溶液。所述电解质可以选自氯化钠、氯化钾、硫酸钠中的一种或几种；优选为氯化钠。所述防腐剂可以选自叠氮钠、proclin300中的一种或两种；优选为叠氮钠。所述缓冲体系可以为磷酸盐缓冲体系、Tris缓冲体系中的一种或两种；优选为磷酸盐缓冲体系。所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液、Tris缓冲液中的一种或两种；优选为磷酸盐缓冲溶液。本专利技术的第二个目的在于提供一种制备上述的视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2的方法，包括如下制备步骤：(1)、将配方量的羧基化聚苯乙烯胶乳微球缓慢滴加分散在缓冲溶液中，加入配方量的EDC溶液，搅拌活化，同时滴加配方量的PAMAM溶液，得到初始液；(2)、往步骤(1)制备的初始液中加入视黄醇结合蛋白单克隆抗体进行偶联反应，反应结束后加入配方量的封闭剂进行封闭反应，并超声分散，得到视黄醇结合蛋白单克隆抗体包被的羧基化聚苯乙烯胶乳溶液；(3)、将适量的恢复液加入到步骤(2)的胶乳溶液中，并调节pH至7.0～8.0，即得视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2。优选地，所述羧基化聚苯乙烯胶乳微球的粒径为50～200nm。优选地，所述EDC溶液中的EDC的浓度为10～20g/L。本专利技术中，所述的活化时间、偶联反应时间、封闭反应时间均为本领域的常规时间。在一些优选实施例中，所述步骤(1)中，所述活化的时间为10～20分钟；所述步骤(2)中，所述偶联反应的时间为1～2小时，所述封闭反应的时间为0.5～1.5小时。在上述优选时间范围内，制备得到本专利技术的试剂R2性能最佳。需要说明的是，本专利技术中，所述的室温通常为15～25℃。调节pH采用盐酸或氢氧化钠溶液。通常采用0.1mol/L的HCl或0.1mol/L的NaOH调节试剂R2的pH。根据本专利技术，所述PAMAM溶液中PAMAM的质量浓度为50～150g/L。根据本专利技术的优选实施例，所述PAMAM溶液中PAMAM的质量浓度为100g/L。本专利技术中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为50～220mmol/L，优选为100～150mmol/L。本专利技术的第三个目的在于提供一种视黄醇结合蛋白试剂盒，所述视黄醇结合蛋白试剂盒包括试剂R1，及上述任一项的视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2。根据本专利技术，所述试剂R1与试剂R2的体积比为2～4:1，优选为3:1。根据本专利技术，所述视黄醇结合蛋白试剂盒中的试剂R1为含5g/L聚乙二醇、2.5g/L的NaCl、1g/L的乙二胺四乙酸二钠的磷酸盐缓冲液，pH为7.0～8.0。根据本专利技术，所述试剂盒的检测范围为：5～210mg/L，优选为18～200mg/L。本专利技术取得的积极进步效果在于：(1)、本专利技术的视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2，加入的聚酰胺-胺树枝状高分子PAMAM溶液可有效降低EDC水解失活的速度，从而提高活化和偶联效率；同时，PAMAM作为一种优良的纳米级表面活性剂，能够提高视黄醇结合蛋白单克隆抗体在偶联体系中的分散性，视黄醇结合蛋白单克隆抗体以树枝状PAMAM高分子为模本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2，其特征在于，所述视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2为pH为7.0～8.0的缓冲体系，所述缓冲体系包含有：视黄醇结合蛋白单克隆抗体包被的羧基化聚苯乙烯胶乳溶液和恢复液，所述胶乳溶液在整个磷酸盐缓冲体系中的含量为400～600mL/L，其中：所述恢复液包含稳定剂、表面活性剂和电解质，所述稳定剂的含量为5～10g/L，表面活性剂的含量为2～5g/L，电解质的含量为5～15g/L；所述恢复液中各组分的含量是指占整个缓冲体系的含量；所述胶乳溶液为pH为5.0～6.0的缓冲溶液，包括：粒径为50～200nm的羧基化聚苯乙烯胶乳微球、活化用的EDC、偶联加速用的PAMAM和封闭剂；所述羧基化聚苯乙烯胶乳微球的含量为10～15g/L，所述EDC的含量为0.5～1g/L，所述PAMAM的含量为1～4g/L，所述封闭剂的含量为2.5～5g/L；所述胶乳溶液中各组分的含量是指占整个胶乳溶液的含量；所述胶乳溶液由羧基化聚苯乙烯胶乳微球经EDC活化后偶联视黄醇结合蛋白单克隆抗体，并由PAMAM维持偶联效率，最后经封闭剂封闭反应得到。
【技术特征摘要】
1.一种视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2，其特征在于，所述视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2为pH为7.0～8.0的缓冲体系，所述缓冲体系包含有：视黄醇结合蛋白单克隆抗体包被的羧基化聚苯乙烯胶乳溶液和恢复液，所述胶乳溶液在整个磷酸盐缓冲体系中的含量为400～600mL/L，其中：所述恢复液包含稳定剂、表面活性剂和电解质，所述稳定剂的含量为5～10g/L，表面活性剂的含量为2～5g/L，电解质的含量为5～15g/L；所述恢复液中各组分的含量是指占整个缓冲体系的含量；所述胶乳溶液为pH为5.0～6.0的缓冲溶液，包括：粒径为50～200nm的羧基化聚苯乙烯胶乳微球、活化用的EDC、偶联加速用的PAMAM和封闭剂；所述羧基化聚苯乙烯胶乳微球的含量为10～15g/L，所述EDC的含量为0.5～1g/L，所述PAMAM的含量为1～4g/L，所述封闭剂的含量为2.5～5g/L；所述胶乳溶液中各组分的含量是指占整个胶乳溶液的含量；所述胶乳溶液由羧基化聚苯乙烯胶乳微球经EDC活化后偶联视黄醇结合蛋白单克隆抗体，并由PAMAM维持偶联效率，最后经封闭剂封闭反应得到。2.根据权利要求1所述的视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2，其特征在于，所述恢复液，还包括防腐剂，所述防腐剂在所述缓冲体系中的浓度为0.5～5g/L。3.根据权利要求1所述的视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2，其特征在于，所述恢复液还包括表面活性剂PAMAM，以提高胶乳的分散稳定性，作为表面活性剂的PAMAM在所述缓冲体系中的浓度为0.5～5g/L。4.根据权利要求1所述的视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2，其特征在于，所述视黄醇结合蛋白单克隆抗体在所述缓冲体系中的浓度为0.2～0.5g/L。5.根据权利要求1所述的视黄醇...
【专利技术属性】
技术研发人员：王青泉，申文君，李宝玉，周健强，
申请(专利权)人：上海执诚生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31
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