一种针对巯基多肽生物样本的前处理方法以及对该生物样本的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种针对巯基多肽生物样本的前处理方法。该方法包括将巯基多肽进行烷基化，同时还对血样进行SSA蛋白沉淀。前处理无需预先分离血浆/血清，在采集血样后室温条件下即可完成反应，可及时锁定巯基多肽的真实水平。巯基多肽经过烷基化后，能够大大提高质谱的离子化效率，从而提升检测的灵敏度，另外还可以提高巯基多肽的稳定性，避免受到其他氧化剂的影响。血样经过SSA蛋白沉淀后，杂质残留少，干扰少，色谱峰型好。使用同位素内标法定量巯基多肽，可以降低基质效应和人为操作误差带来的影响，结果更准确。质谱检测方法准确度和精密度更高。本发明专利技术还公开了一种对前处理后的巯基多肽生物样本的检测方法。

A pretreatment method for thiol polypeptide biological samples and a detection method for thiol polypeptide biological samples

【技术实现步骤摘要】
一种针对巯基多肽生物样本的前处理方法以及对该生物样本的检测方法
本专利技术涉及仪器分析质谱检测领域，特别是涉及一种生物样本中含有自由巯基多肽的烷基化前处理和串联质谱检测方法。
技术介绍
目前针对生物样本中含有巯基多肽的检测，全血分离出血浆后，在特定温度或pH条件下，用自合成的芳香季胺化咪唑进行较长时间衍生处理，使用灵敏度较低的方法进行检测。目前生物样本中含巯基多肽的衍生化方法存在许多不足：1、样本前处理复杂，部分需要预先分离出血浆；2、操作烦琐，需要在特定温度，特定pH条件下反应；3、所需时间长，衍生化不彻底，重复性和灵敏度差；4、衍生化处理后直接上机检测，或使用pH接近中性或偏碱性的蛋白沉淀试剂，如甲醇、乙腈等，这类试剂沉淀蛋白效果不佳，导致杂质残留多，影响目标物的检测和分离。因此，市面上亟需一种能够解决上述一个或者多个问题的针对巯基多肽生物样本的前处理方法以及对该生物样本的检测方法。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的一个或者多个问题，本专利技术提供了一种针对巯基多肽生物样本的前处理方法以及对该生物样本的检测方法。本专利技术为达到上述目的所采用的技术方案是：一种针对巯基多肽生物样本的前处理方法，所述方法包括：步骤01、制备巯基烷化剂，装入到若干EP管中备用；步骤02、分别在步骤01中的各个EP管中加入不同浓度的巯基多肽物质标曲工作液和待测样品；步骤03、分别在步骤02的各个EP管中加入巯基多肽物质内标工作液，充分混匀后在室温中静置；步骤04、分别在步骤03的各个EP管中加入SSA蛋白沉淀剂，涡旋混匀，离心处理；步骤05、从步骤04的各个EP管中取出上清液，加入到装有超纯水的EP管中，涡旋混匀；步骤06、从步骤05各管中取出混合液，分别加入装有超纯水的EP管中，涡旋混匀，转移到96孔板中，封膜待测。在一些实施例中，所述步骤01中的巯基烷化剂包括N-R基顺丁烯二酰亚胺。在一些实施例中，所述N-R基顺丁烯二酰亚胺为N-甲基顺丁烯二酰亚胺，N-乙基顺丁烯二酰亚胺，N-苄基顺丁烯二酰亚胺中的一种或几种。在一些实施例中，所述步骤01中制备巯基烷化剂包括：步骤11、准确称取100.1mg的N-乙基顺丁烯二酰亚胺，和59.6mg的乙二胺四乙酸二钠；步骤12、将步骤11中称取的N-乙基顺丁烯二酰亚胺和乙二胺四乙酸二钠加入到40ml的超纯水中，震荡混匀2min，即得20mM的巯基烷化剂。在一些实施例中，所述步骤03中充分混匀后需要在室温中静置15min。在一些实施例中，所述步骤04中的SSA蛋白沉淀剂浓度为8％，离心处理条件：离心转速为15000rpm，温度为4摄氏度，离心时间为5min。在一些实施例中，所述步骤05中上清液的体积为10μL，超纯水的体积为990μL。在一些实施例中，所述步骤06具体为：从步骤05各管中取出10μL混合液，分别加入含有990μL超纯水的1.5mLEP管中，涡旋混匀，转移200μL到96孔板中，封膜待测。在一些实施例中，所述待测样品用EDTA抗凝管采集健康人全血后上下颠倒混匀；所述待测样品为抗凝全血、血清、血浆或者唾液中一种。本专利技术还提出了一种对前处理后的巯基多肽生物样本的检测方法，所述方法包括：步骤01、将待测样品和标曲工作液按照上述的前处理方法进行处理；步骤02、设置前处理后的标曲工作液为对照组；步骤03、对前处理后的样品和前处理后的标曲工作液用液相色谱串联质谱仪进行检测；所述液相色谱串联质谱仪的检测条件包括：色谱柱为C18柱，进样量10μL，乙腈溶液为流动相B，甲酸铵和甲酸的混合溶液为流动相A，采用多反应监测模式进行检测。本专利技术的有益效果是：本专利技术前处理方法简单，无需预先分离血浆/血清，在采集血样后室温条件下15min就可完成反应，无需在特定温度或pH条件下反应，可及时锁定含巯基多肽的真实水平。含巯基多肽经过烷基化后，能够大大提高质谱的离子化效率，从而提升检测的灵敏度，另外还可以提高巯基多肽的稳定性，避免受到其他氧化剂的影响。血样经过SSA蛋白沉淀后，杂质残留少，干扰少，色谱峰型好。使用同位素内标法定量含巯基多肽，可以降低基质效应和人为操作误差带来的影响，结果更准确。质谱检测方法经过方法学验证，准确度和精密度更高。附图说明图1为本专利技术较佳实施例一种对前处理后的巯基多肽生物样本的检测方法示意图；图2为本专利技术实施例1中的线性回归曲线；图3为本专利技术实施例3中的SSA蛋白沉淀色谱图；图4为本专利技术实施例3中的未沉淀蛋白色谱图；图5为本专利技术实施例4中的健康人GSH浓度分布图。具体实施方式为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加浅显易懂，下面结合附图对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术。但是本专利技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似改进，因此本专利技术不受下面公开的具体实施例的限制。参照图1所示，本专利技术公开了一种含巯基的多肽—谷胱甘肽(GSH)的前处理方法，所述方法包括：步骤1：在六个1.5mLEP管中加入200μL的巯基烷化剂，标记为1号EP管、2号EP管、3号EP管、4号EP管、5号EP管和6号EP管；步骤2：分别往1号EP管、2号EP管、3号EP管、4号EP管、5号EP管加入100μL的C1-C5标曲工作液(其中C1-C5标曲工作液的浓度和配置方法参照图表1)，往6号EP管中加入待测样品；步骤3：分别往1号EP管、2号EP管、3号EP管、4号EP管、5号EP管和6号EP管中各加入10μL的GSH-IS工作液，充分混匀后在室温中静置15min；步骤4：分别往1号EP管、2号EP管、3号EP管、4号EP管、5号EP管和6号EP管加入200μL的8％SSA蛋白沉淀剂，涡旋混匀，15000rpm，4℃离心5min；步骤5：分别从1号EP管、2号EP管、3号EP管、4号EP管、5号EP管和6号EP管中取出10μL上清液，分别加入到含990μL超纯水的1.5mLEP管中，涡旋混匀；步骤6：从步骤5各管中取出10μL，分别加入含有990μL超纯水的1.5mLEP管中，涡旋混匀，转移200μL到96孔板中，封膜待测。需要说明的是，待测样品为抗凝全血、血清、血浆或者唾液中一种，优选地为EDTA抗凝全血。用EDTA抗凝管采集健康人全血后上下颠倒混匀，如样品未能及时检测，需冷藏保存。巯基烷化剂包含N-R基顺丁烯二酰亚胺，如N-甲基顺丁烯二酰亚胺，N-乙基顺丁烯二酰亚胺，N-苄基顺丁烯二酰亚胺等，优选的为N-乙基顺丁烯二酰亚胺。巯基烷化剂制备方法如下：准确称取100.1mg的N-乙基顺丁烯二酰亚胺，和59.6mg的乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)，加入到40mL的超纯水中，震荡混匀2min，即得20mM的巯基烷化剂。8％SSA蛋白沉淀剂通过准确称取3.2g的5-磺基水杨酸(SSA)溶解于40mL的超纯水中制得。GSH储备液即为还原型谷胱甘肽(GSH)储备液,其制备过程如下：准确称量50mgGSH，加入含50mL15％甲醇的容量瓶中，摇匀。按每管0.5mL分装到1.5mLEP管中，-20℃储存备用。GSH标曲工作液以GSH储备液为基础，配制而成，具体方法参照表1所示。GSH-IS储备液即为还原型谷胱甘肽内标储本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种针对巯基多肽生物样本的前处理方法，其特征在于，所述方法包括：步骤01、制备巯基烷化剂，装入到若干EP管中备用；步骤02、分别在步骤01中的各个EP管中加入不同浓度的巯基多肽物质标曲工作液和待测样品；步骤03、分别在步骤02的各个EP管中加入巯基多肽物质内标工作液，充分混匀后在室温中静置；步骤04、分别在步骤03的各个EP管中加入SSA蛋白沉淀剂，涡旋混匀，离心处理；步骤05、从步骤04的各个EP管中取出上清液，加入到装有超纯水的EP管中，涡旋混匀；步骤06、从步骤05各管中取出混合液，分别加入装有超纯水的EP管中，涡旋混匀，转移到96孔板中，封膜待测。

【技术特征摘要】
1.一种针对巯基多肽生物样本的前处理方法，其特征在于，所述方法包括：步骤01、制备巯基烷化剂，装入到若干EP管中备用；步骤02、分别在步骤01中的各个EP管中加入不同浓度的巯基多肽物质标曲工作液和待测样品；步骤03、分别在步骤02的各个EP管中加入巯基多肽物质内标工作液，充分混匀后在室温中静置；步骤04、分别在步骤03的各个EP管中加入SSA蛋白沉淀剂，涡旋混匀，离心处理；步骤05、从步骤04的各个EP管中取出上清液，加入到装有超纯水的EP管中，涡旋混匀；步骤06、从步骤05各管中取出混合液，分别加入装有超纯水的EP管中，涡旋混匀，转移到96孔板中，封膜待测。2.根据权利要求1所述的针对巯基多肽生物样本的前处理方法，其特征在于，所述步骤01中的巯基烷化剂包括N-R基顺丁烯二酰亚胺。3.根据权利要求2所述的针对巯基多肽生物样本的前处理方法，其特征在于，所述N-R基顺丁烯二酰亚胺为N-甲基顺丁烯二酰亚胺，N-乙基顺丁烯二酰亚胺，N-苄基顺丁烯二酰亚胺中的一种或几种。4.根据权利要求1所述的针对巯基多肽生物样本的前处理方法，其特征在于，所述步骤01中制备巯基烷化剂包括：步骤11、准确称取100.1mg的N-乙基顺丁烯二酰亚胺，和59.6mg的乙二胺四乙酸二钠；步骤12、将步骤11中称取的N-乙基顺丁烯二酰亚胺和乙二胺四乙酸二钠加入到40mL的超纯水中，震荡混匀2min，即得20mM的巯基烷化剂。5.根据权利要求1所述的针对巯基多肽生物...

【专利技术属性】
技术研发人员：张良滔，陈婉婷，饶琳，田瑶林，
申请(专利权)人：深圳健科医学检验实验室，
类型：发明
国别省市：广东,44