miR-766-3p和miR-766-5p在制备高级别胶质瘤和颅内淋巴瘤诊断和鉴别诊断制剂中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种肿瘤诊断试剂,所述肿瘤诊断试剂能够检测样本中miR‑766‑3p和miR‑766‑5p的表达情况,miR‑766‑3p序列为：actcca gccccacagc ctcagc；miR‑766‑5p序列为:g gaggaattgg tgctggtctt。本发明专利技术首先通过miSeq高通量测序技术筛选在颅内淋巴瘤患者，高级别胶质瘤患者和正常对照血清外泌体中miR‑766‑3p和miR‑766‑5p的表达有差异。并在临床标本中采用RT‑PCR检测miR‑766‑3p和miR‑766‑5p的表达，评估miR‑766‑3p和miR‑766‑5p对高级别胶质瘤和颅内淋巴瘤的诊断和鉴别诊断价值，提出了miR‑766‑3p和miR‑766‑5p在作为颅内淋巴瘤、高级别胶质瘤诊断制剂、诊断试剂盒的应用。

Application of microRNA-766-3p and microRNA-766-5p in the preparation of diagnostic and differential diagnostic agents for high-grade glioma and intracranial lymphoma

【技术实现步骤摘要】
miR-766-3p和miR-766-5p在制备高级别胶质瘤和颅内淋巴瘤诊断和鉴别诊断制剂中的应用
本专利技术属于基因检测
，涉及血清外泌体在肿瘤诊断中的应用，具体涉及miR-766-3p和miR-766-5p在制备高级别胶质瘤和颅内淋巴瘤诊断和鉴别诊断制剂中的应用。
技术介绍
胶质瘤为起源于胶质或前体细胞的肿瘤，是人类最常见的颅内肿瘤之一。按肿瘤细胞在病理学上的恶性程度可以将胶质瘤划分为：低级别胶质瘤（WHOⅠ和Ⅱ级）和高级别胶质瘤（WHOⅢ和Ⅳ级）。高级别胶质瘤为低分化胶质瘤，是高度增殖和侵袭性的肿瘤，具有难治性、易局部播散和易复发等特点，预后极差，生存期短。制定合理的治疗方案延长患者的生存期，离不开准确的诊断。目前胶质瘤诊断的“金标准”是组织学病理活检,然而大部分胶质瘤位于颅内重要部位，且位置深在，而且病理活检手术创伤大，患者及家属常难以接受,因此很难获得病理标本用于诊断。初诊的胶质瘤的诊断主要依靠影像学手段，而影像学诊断面临的主要难题是手术前胶质瘤的鉴别诊断（例如颅内原发淋巴瘤与高级别胶质瘤的鉴别）。寻找高敏感度和高特异度的生物学标志物用于高级别胶质瘤的术前诊断和鉴别诊断刻不容缓。外泌体(exosomes)是细胞分泌的有双层脂质膜的囊泡，是细胞之间生命活动物质交换的一种重要工具，可通过改变基因调控网络或表观遗传重组来调控生理病理过程。外泌体具有如下特点：（1）特异性：在不同生理或病理条件下，释放到胞外的外泌体的内含物也有所不同。在病理生理状态下细胞应是选择性将miRNA装载入外泌体中，细胞中表达水平低的miRNA，在外泌体中却有很高的表达量。（2）稳定性：由于有双层脂质膜的保护，酶不易消化外泌体的内含物，室温和冻融对外泌体中miRNA的影响甚微。（3）易获取性：现有技术能快速和准确地分离广泛分布于各种类型的体液中的外泌体。（4）易通过血脑屏障：外泌体粒径较小,体内渗透性强，极易透过血脑屏障，即使在一些血脑屏障保持完好的胶质瘤患者血液中，也能检测出胶质瘤细胞的外泌体。因此，外周血外泌体中的miRNA可成为有效地神经系统肿瘤的标志物。基于高通量测序技术及生物信息学方法，可筛选血清外泌体中与肿瘤发生、发展相关循环核酸分子（主要为miRNA）及易感基因，建立miRNA差异表达谱，构建基因调控网络，寻找肿瘤诊断的循环核酸标志物。成熟的RT-PCR技术，可以实现核酸标志物的定量检测，验证评估后用于肿瘤的诊断和鉴别诊断。
技术实现思路
本专利技术针对传统高级别胶质瘤和颅内淋巴瘤诊断和鉴别诊断中存在的问题提出miR-766-3p和miR-766-5p在高级别胶质瘤和颅内淋巴瘤诊断和鉴别诊断中的应用。为了达到上述目的，本专利技术是采用下述的技术方案实现的：肿瘤诊断试剂,所述肿瘤诊断试剂能够检测样本中miR-766-3p和miR-766-5p的表达情况,miR-766-3p序列为：actccagccccacagcctcagc；miR-766-5p序列为:ggaggaattggtgctggtctt。作为优选，所述肿瘤为高级别胶质瘤和颅内淋巴瘤。作为优选，肿瘤诊断试剂采用高通量测序方法和/或定量PCR方法检测样本中miR-766-3p和miR-766-5p的表达情况。作为优选，所述高通量测序方法是指illumina公司推出的二代测序技术。作为优选，所述用于定量PCR方法包括特异性扩增miR-766-3p和miR-766-5p的引物。作为优选，所述样本为外周血血清外泌体。一种肿瘤诊断试剂盒，该试剂盒包含扩增miR-766-3p和miR-766-5p的引物，所述引物序列miR-766-3p为：反向引物5,-TAAGGTTCATCACGACAGGTTCAC-3，正向引物5,-ATTCATTACTCCAGCCCCACA-3；miR-766-5p为：反向引物5,-TATGGTTGTTCACGACTGGTTCAC-3，正向引物5,-TTGCTAGGAGGAGGAATTGGTG-3。所述诊断试剂或诊断试剂盒在制备高级别胶质瘤和颅内淋巴瘤制剂中的应用。miRNA定义：miRNA是一类内源性、高度保守的、长度大约为22个核苷酸的非编码小分子RNA，在转录后水平发挥调控作用。近年来，循环miRNA作为各类疾病标志物的研究备受关注。外泌体miRNA是指存在于血清、血浆、一些体液如唾液、尿液和脑脊液外泌体中的miRNA的统称。外泌体miRNA作为一个较新且有前景的研究领域，近几年关于其作为肿瘤诊断标志物的研究成为热点。(1)实时荧光定量PCR技术(Real-timePCR，RT-PCR)荧光检测PCR仪可对整个PCR过程中扩增序列的累积速率绘制动态变化曲线。在反应混合体系中靶序列的起始浓度越大，要求获得扩增产物某特定产量的PCR循环数(一般用特定阈值循环数Ct来表达)越少。RT-PCR具有特异性高、灵敏度好、快速简单等多种优点。由于miRNA长度仅为22nt，传统的RT-PCR不适合扩增如此短的片段。现今有几种用于miRNA的实时定量PCR方法，如加尾法、颈环法等。颈环法是一种理想的miRNA检测RT-PCR方法：首先设计特殊的茎环结构引物，以待测miRNA为模板逆转录合成cDNA第一链，该cDNA一端为茎环状引物，茎环状结构被打开便增加了cDNA的长度，随后以合成的cDNA为模板设计引物进行实时定量PCR扩增。(2)测序法大部分已知的miRNA都是通过cDNA克隆测序发现和鉴定的。该法需要先构建miRNA的cDNA文库，再进行PCR扩增，扩增产物随后克隆到表达载体上测序。高通量测序又称下一代测序技术，是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，极大提高了测序效率。同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deepsequencing)。与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果在于：本专利技术首先通过miSeq高通量测序技术筛选在颅内淋巴瘤患者，高级别胶质瘤患者和正常对照血清外泌体中miR-766-3p和miR-766-5p的表达有差异（图1）。并在临床标本中采用RT-PCR检测miR-766-3p和miR-766-5p的表达（图2），评估miR-766-3p和miR-766-5p对高级别胶质瘤（图3）和颅内淋巴瘤的诊断（图4）和鉴别诊断价值（图5），提出了miR-766-3p和miR-766-5p在作为颅内淋巴瘤、高级别胶质瘤诊断制剂、诊断试剂盒的应用。附图说明图1为颅内淋巴瘤，高级别胶质瘤和正常对照差异miRNA聚类图。以log10（TPM+1）值进行聚类。图2为miR-766-3p和miR-766-5p在健康对照组、颅内淋巴瘤和高级别胶质瘤中的表达。图3为miR-766-3p和miR-766-5p诊断高级别胶质瘤的ROC曲线。图4为miR-766-3p和miR-766-5p诊断颅内淋巴瘤的ROC曲线。图5为miR-766-3p和miR-766-5p对胶质瘤和颅内淋巴瘤的鉴别诊断的ROC曲线。具体实施方式为了能够更清楚地理解本专利技术的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测miR‑766‑3p的试剂和miR‑766‑5p的试剂在制备高级别胶质瘤和颅内淋巴瘤诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述miR‑766‑3p序列为：actcca gccccacagc ctcagc；miR‑766‑5p序列为:g gaggaattgg tgctggtctt；所述检测miR‑766‑3p的试剂序列为：反向引物5,‑TAAGGTTCATCACGACAGGTTCAC‑3，正向引物5,‑ATTCATTACTCCAGCCCCACA‑3；miR‑766‑5p的试剂序列为：反向引物5,‑TATGGTTGTTCACGACTGGTTCAC‑3，正向引物5,‑TTGCTAGGAGGAGGAATTGGTG‑3。

【技术特征摘要】
1.检测miR-766-3p的试剂和miR-766-5p的试剂在制备高级别胶质瘤和颅内淋巴瘤诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述miR-766-3p序列为：actccagccccacagcctcagc；miR-766-5p序列为:ggaggaattggtgctggtctt；所述检测miR-766-3p的试剂序列为：反向引物5,-TAAGGTTCATCACGACAGGTTCAC-3，正向引物5,-ATTCATTACTCCAGCCCCACA-3；miR-766-5p的试剂序列为：反向引物5,-TATGGTTGTTCACGACTGGTTCAC-3，正向引物5,-TTGCTAGGAGGAGGAATTGGTG-3。2.根据权利要求1所述应用,其特征在于:采用高通量测序方...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜军，
申请(专利权)人：山东大学第二医院，
类型：发明
国别省市：山东,37