一种类胡萝卜素酯的酶催化制备方法技术

本发明专利技术涉及一种酶催化制备类胡萝卜素酯的方法。使用该方法制备叶黄素酯具有90％以上的底物转化率，得到的叶黄素酯纯度≥99％。所制备的固定化脂肪酶催化剂中酶的负载率达到30％以上，并且酶活性基本与天然酶保持一致；该微球型催化剂粒径在15微米左右，粒径分布较均一，具有多孔多层的纳米结构，便于酶催化反应中的底物传递，适合在连续的填充床式反应器或流化床反应器中使用。该方法所制备的产物分离提纯简单，后处理成本低，整个工艺流程温和、可控且环境友好。

Enzymatic preparation of carotenoid esters

【技术实现步骤摘要】
一种类胡萝卜素酯的酶催化制备方法
本专利技术涉及一种酶催化制备类胡萝卜素酯的方法，属于生物化工领域，用于制备医药中间体。
技术介绍
叶黄素，别名类胡萝卜素、胡萝卜醇、植物黄体素、核黄体、万寿菊花素及植物叶黄素等，英文名为Lutein，分子式为C40H56O2，相对分子量为568.85。橙黄色粉末，浆状或液体，不溶于水，溶于己烷等有机溶剂。天然叶黄素是一种优良的抗氧化剂，能抵御游离基在人体内造成细胞与器官损伤，从而可防止机体衰老引发的心血管硬化、冠心病和肿瘤病等。叶黄素和玉米黄质是眼睛中仅有的2种类胡萝卜素，预防老年性眼球视网膜黄斑区病变引起的视力下降与失明是叶黄素的独特功能。叶黄素酯是一种重要的类胡萝卜素脂肪酸酯。它广泛存在于万寿菊花、南瓜、甘蓝、苜蓿等植物体内。其中，在万寿菊花中含量最为丰富，高达30％～40％。在万寿菊花和其它植物中，叶黄素一般与脂肪酸(如月桂酸、棕搁酸等)结合成酯的形式存在。自然界中的叶黄素酯可分为反式叶黄素酯和顺式叶黄素酯，是以全反式分子构型为主。全反式叶黄素醋又可分为叶黄素单酯和叶黄素二酯。在常温下，高纯度的叶黄素酯(含量60％～95)呈金黄色至橙红色粉末。它易溶于氯仿、二氯甲烷、二氯化碳等氯代烃，可溶于正己烷、丙酮、乙酸乙酯、乙醇等溶剂。其稳定性较强，只有高温、强酸、铁离子和氧等因素对叶黄素酯破坏较大。目前，合成叶黄素酯的方法主要靠传统的有机合成方法。其过程是由油酸先制备油酸酰氯，然后油酸酰氯再制备成油酸酐，最后油酸酐与叶黄素反应得到叶黄素酯。从反应过程来看，需要用到酰氯，另外该反应过程温度较高，不利于叶黄素的稳定。酶催化反应在有机化学中是一种必需工具，酶专一性使许多反应可通过一步反应合成其它手段需要多步合成的化合物。另外，酶催化反应的一些特点低温、高选择性和副产物少等为其在脂质合成工业化生产中发挥重要作用。目前，国内外关于脂肪酶催化酯类合成的研究主要应用在山梨醇油酸、蜡酯、VA乳酸酯和风味酯的合成。在合成叶黄素衍生物方面还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有有机合成方法合成叶黄素酯时需要用到酰氯，另外该有机合成方法反应过程温度较高，不利于叶黄素的稳定等缺陷，而直接进行酶催化制备叶黄素酯存在酶失活的缺陷，提供一种可高效制备叶黄素酯的酶催化方法，解决现阶段叶黄素酯产量低、价格高的问题。具体为，将工业脂肪酶分散在磷酸盐缓冲液中，然后滴加氯化钙溶液得到固定化脂肪酶-无机磷酸钙晶体杂化催化剂，以此杂化催化剂催化叶黄素与脂肪酸进行酯化制备叶黄素酯，经过纯化得到叶黄素酯纯品。本专利技术解决上述问题采用的技术方案，酶催化制备叶黄素酯方法的步骤以下：(1)脂肪酶固定化：将脂肪酶Novozym435溶解于100～300mL、pH值为7.0～8.0的磷酸盐缓冲液中，浓度为1.0～5.0g/L，然后在100～300r/min的搅拌速率下以60～120滴/min的速率滴入0.1～2.0mol/L的氯化钙水溶液100～300mL，搅拌反应2～6h后过滤得到固定化脂肪酶-无机磷酸钙晶体杂化催化剂；(2)酶催化制备叶黄素酯：将叶黄素和脂肪酸按摩尔比为0.5～1∶2～6加入氯仿中配成10～20g/L的溶液，然后加入反应物1～2wt％的步骤(1)制备的固定化酶催化剂，于20～60℃氮气浴摇床下，避光振荡反应10～20h，然后加入反应物1～2wt％的活化的4A°分子筛，继续反应10～20h；其中，脂肪酸为没食子酸、咖啡酸或棕榈酸；(3)叶黄素酯的提纯：将步骤(2)制备得到的叶黄素酯粗产品用柱层析的方法提纯，其中所用的洗脱剂为石油醚，旋除溶剂得到叶黄素酯纯品，纯度≥99％。所述的酶催化制备叶黄素酯的方法，该方法固定化脂肪酶-无机磷酸钙晶体杂化催化剂粒径在15～30微米，粒径分布较均一，非常适用于制备固定床酶反应器，微球型催化剂具有多孔多层的纳米结构，方便酶催化反应中的底物传递。所述的酶催化制备叶黄素酯的方法，该方法固定化酶的收率达到90％以上，固定化酶的蛋白负载量为30％以上。所述的一种酶催化制备叶黄素酯的方法，该酶催化制备得到的叶黄素酯纯度≥99％，酶催化制备得到叶黄素酯的方法具有90％以上的底物转化率，整个制备过程温和、绿色、可控。本专利技术的有益效果：使用该方法制备叶黄素酯具有90％以上的底物转化率，得到的叶黄素酯纯度≥99％。所制备的固定化脂肪酶催化剂中酶的负载率达到30％以上，并且酶活性基本与天然酶保持一致；该微球型催化剂粒径在15微米左右，粒径分布较均一，具有多孔多层的纳米结构，便于酶催化反应中的底物传递，适合在连续的填充床式反应器或流化床反应器中使用。该方法所制备的产物分离提纯简单，后处理成本低，整个工艺流程温和可控且环境友好。具体实施方式以下介绍本专利技术制备方法的实施例，但以下实施例是用于说明本专利技术的示例，并不构成对本专利技术权利要求的任何限定。实施例1制备叶黄素二没食子酸酯，其反应方程式如式I所示。(1)脂肪酶固定化：将脂肪酶Novozym435溶解于100mL的pH值为7.5的磷酸盐缓冲液中，浓度为1.0g/L，然后在100r/min的搅拌速率下以60滴/min的速率滴入0.1mol/L的氯化钙水溶液100mL，搅拌反应2h后过滤得到固定化脂肪酶-无机磷酸钙晶体杂化催化剂；(2)酶催化制备叶黄素酯：将物质的量比为1∶2的叶黄素和没食子酸加入氯仿中配成10g/L的溶液，然后加入反应物1wt％的步骤(1)制备的固定化酶催化剂，于40℃氮气浴摇床下，避光振荡反应20h，然后加入反应物2wt％的活化的4A°分子筛，继续反应10h；(3)叶黄素酯的提纯：将步骤(2)制备得到的叶黄素酯粗产品用柱层析的方法提纯，其中所用的洗脱剂为石油醚，旋除溶剂得到叶黄素酯纯品。其中叶黄素二没食子酸酯的纯度为99％，酶催化制备得到叶黄素二没食子酸酯的方法具有92％以上的底物转化率。实施例2制备叶黄素二咖啡酸酯，其反应方程式如式II所示。(1)脂肪酶固定化：将脂肪酶Novozym435溶解于100mL的pH值为7.5的磷酸盐缓冲液中，浓度为1.0g/L，然后在200r/min的搅拌速率下以100滴/min的速率滴入0.1mol/L的氯化钙水溶液100mL，搅拌反应6h后过滤得到固定化脂肪酶-无机磷酸钙晶体杂化催化剂；(2)酶催化制备叶黄素酯：将物质的量比为1∶2的叶黄素和咖啡酸加入氯仿中配成10g/L的溶液，然后加入反应物1wt％的步骤(1)制备的固定化酶催化剂，于40℃氮气浴摇床下，避光振荡反应12h，然后加入反应物2wt％的活化的4A°分子筛，继续反应12h；(3)叶黄素酯的提纯：将步骤(2)制备得到的叶黄素酯粗产品用柱层析的方法提纯，其中所用的洗脱剂为石油醚，旋除溶剂得到叶黄素酯纯品。其中叶黄素二咖啡酸酯的纯度为99％，酶催化制备得到叶黄素二咖啡酸酯的方法具有93％以上的底物转化率。实施例3制备叶黄素二棕榈酸酯，其反应方程式如式III所示。(1)脂肪酶固定化：将脂肪酶Novozym435溶解于100mL的pH值为7.5的磷酸盐缓冲液中，浓度为1.0g/L，然后在200r/min的搅拌速率下以60滴/min的速率滴入0.1mol/L的氯化钙水溶液100mL，搅拌反应3h后过滤得到固定化脂肪酶-无机磷酸钙晶体杂化催化本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酶催化制备类胡萝卜素酯的方法，其特征在于：酶催化制备类胡萝卜素酯方法的步骤如下：(1)脂肪酶固定化：将脂肪酶Novozym435溶解于100～300mL、pH值为7.0～8.0的磷酸盐缓冲液中，浓度为1.0～5.0g/L，然后在100～300r/min的搅拌速率下以60～120滴/min的速率滴入0.1～2.0mol/L的氯化钙水溶液100～300mL，搅拌反应2～6h后过滤得到固定化脂肪酶‑无机磷酸钙晶体杂化催化剂；(2)酶催化制备叶黄素酯：将叶黄素和脂肪酸按摩尔比为0.5～1∶2～6加入氯仿中配成10～20g/L的溶液，然后加入反应物1～2wt％的步骤(1)制备的固定化酶催化剂，于20～60℃氮气浴摇床下，避光振荡反应10～20h，然后加入反应物1～2wt％的活化的4A°分子筛，继续反应10～20h；其中，脂肪酸为没食子酸、咖啡酸或棕榈酸；(3)叶黄素酯的提纯：将步骤(2)制备得到的叶黄素酯粗产品用柱层析的方法提纯，其中所用的洗脱剂为石油醚，旋除溶剂得到叶黄素酯纯品，纯度≥99％。

【技术特征摘要】
1.一种酶催化制备类胡萝卜素酯的方法，其特征在于：酶催化制备类胡萝卜素酯方法的步骤如下：(1)脂肪酶固定化：将脂肪酶Novozym435溶解于100～300mL、pH值为7.0～8.0的磷酸盐缓冲液中，浓度为1.0～5.0g/L，然后在100～300r/min的搅拌速率下以60～120滴/min的速率滴入0.1～2.0mol/L的氯化钙水溶液100～300mL，搅拌反应2～6h后过滤得到固定化脂肪酶-无机磷酸钙晶体杂化催化剂；(2)酶催化制备叶黄素...

【专利技术属性】
技术研发人员：张天，张楹川，
申请(专利权)人：西安岳达生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西,61