本发明专利技术公开了一种同时检测乳制品中β‑乳球蛋白和a‑乳白蛋白两种过敏原的方法，属于生物免疫分析领域。该方法将β‑乳球蛋白和α‑乳白蛋白标准品等量混合作为包被抗原，抗β‑乳球蛋白抗体和α‑乳白蛋白抗体等量混合成混合抗血清作为一抗，羊抗兔IgG辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体为二抗，四甲基联苯胺(TMB)作为底物显色液，然后建立灵敏、特异性强的间接竞争ELISA，最后对结果进行数据分析。该方法不仅具有ELISA法的灵敏度高、特异性强、重复性好特点，而且最大优势在于省时省力，一次可包被两种抗原，并同时检测两种抗原性，突破以往检测单一过敏原的模式，可用于同时检测乳制品中过敏原β‑乳球蛋白和a‑乳白蛋白的总含量。
Simultaneous detection of beta-lactoglobulin and a-lactalbumin in dairy products
【技术实现步骤摘要】
同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法
本专利技术涉及生物免疫分析
，尤其涉及一种同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法。
技术介绍
乳制品富含蛋白质及多种矿物质，但其是一类容易引起过敏的食物，在儿童中发病率大约为0.3％-7.5％，食物过敏是由某种食物或食品添加剂等引起的IgE介导和非IgE介导的免疫反应，可导致消化系统或全身性的变态反应。近些年由于生活方式的改变、微生物的暴露、饮食习惯的改变等多种因素，婴幼儿的肠道免疫功能越来越低下，越来越多的婴幼儿患有牛乳蛋白过敏，这对他们的生活和家庭都带来极大的不便。牛乳蛋白过敏(cowmilkproteinallergy，CMPA)是指由牛奶蛋白引起的异常或过强的免疫反应，一般情况下，特应性皮炎是婴幼儿CMPA的主要表现形式，这是一种慢性反复，伴有瘙痒的皮肤病，荨麻疹为常见的表现形式。经研究表明，CMPA主要致病原因是由乳糖中的αs1-酪蛋白(αs1-casein,αs1-CN)、α-乳白蛋白(α-lactalbumin,α-La)和β-乳球蛋白(β--lactoglobulin,β-Lg)作为常见过敏原而引起的，这些蛋白都含有可以被免疫系统识别的抗原表位，包括构象表位和线性表位。人乳中不含有β-乳球蛋白，因此它被认为是最主要的牛乳过敏原之一，有研究证明，82％的牛乳过敏患者对β-乳球蛋白过敏。α-乳白蛋白与人乳相比，虽有74％的氨基酸相同，但目前也是公认的引发牛乳过敏的主要过敏原之一，研究表明有75％的牛乳过敏患者血清中含有α-乳白蛋白的特异性抗体。因此，乳制品中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白都是主要过敏原。目前婴幼儿对乳制品过敏现象越来越多，因此准确检测其中过敏原尤为重要。目前乳制品中的定量检测的方法主要有酶联免疫法和高效液相色谱法，高效液相仪器价格昂贵，成本较大，酶联免疫法凭借高灵敏、快速、处理样品多等特点颇受欢迎，但目前运用酶联免疫法检测得都是单一的过敏原，但目前针对运用酶联免疫法检测多种过敏源的报道较少，同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法目前还未见报道。
技术实现思路
本专利技术针对上述技术问题，基于间接竞争酶联免疫原理，提供一种同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其优点既具备了快速、高灵敏，又能同时检测两种过敏原，达到了省时省力的效果。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案如下：同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，将β-乳球蛋白和α-乳白蛋白标准品等量混合作为包被抗原，抗β-乳球蛋白抗体和α-乳白蛋白抗体等量混合成混合抗血清作为一抗，采用间接竞争酶联免疫法同时检测两种过敏原的抗原性，其中，抗原包被的质量浓度为0.2～10.0μg/ml，混合抗血清的稀释度为1:4000～16000。优选地，抗原包被的质量浓度为0.5～5.0μg/ml，混合抗血清的稀释度为1:8000～12000。更优选地，抗原包被的质量浓度为5.0μg/ml，混合抗血清的稀释度为12000。优选地，酶标二抗采用羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记抗体，其稀释浓度为1:5000～1:40000。更优选地，酶标二抗采用羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记抗体，其稀释浓度为1:10000。上述的同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，包括以下步骤：标准曲线的建立、样品吸光值测定、以及根据标准曲线计算得到牛乳中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的浓度。具体地，标准曲线的建立方法为：(1)抗原包被：将包被抗原稀释到所述的质量浓度，每孔100μL包被酶标板，37℃包被2h；(2)洗涤：倾倒孔内液体，PBST震荡洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液；(3)封闭：按每孔100μL加入封闭液，37℃封闭1h，弃封闭液，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液；(4)竞争结合：用PBS稀释β-乳球蛋白和a-乳白蛋白混合标准品，做0.1ng/ml～1000ng/ml梯度稀释，并与所述的稀释度的混合抗血清预混，预混液每孔100μL，37℃反应1.5h，倾倒孔内液体，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液；(5)加酶标二抗：加入羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记抗体，每孔100μL，37℃反应1h，倾倒孔内液体，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液；(6)显色：加入新鲜预混的TMB双组分显色液，每孔100μL，37℃反应10min；(7)终止反应：每孔加入50μL终止液终止反应；(8)吸光值测定：采用双波长测定各孔的OD450和OD620值，实际OD＝OD450-OD620；(9)标准曲线的绘制：将混合β-乳球蛋白和a-乳白蛋白标品各浓度对应的OD值转换成B/B0的％值，抗原浓度为0时的OD值为B0，其余浓度对应的OD值为B；以B/B0％值为纵坐标，以相对应的抗原浓度的对数为横坐标，制作标准曲线；(10)线性回归线段：选择标准曲线呈明显相关的区段，根据公式Logit((B/B0)％)＝ln(B/(B0-B))，计算各标准点的Logit((B/B0)％)，再做对应的抗原浓度的对数的Logit((B/B0％)回归分析。样品吸光值测定的方法为：(1)抗原包被：将包被抗原稀释到所述的质量浓度，每孔100μL包被酶标板，37℃包被2h；(2)洗涤：倾倒孔内液体，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液；(3)封闭：按每孔100μL加入封闭液，37℃封闭1h，弃封闭液，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液；(4)抗原抗体结合：将待测样品分别处理为所述稀释度的待测液，并与所述稀释度的混合抗血清预混，预混液每孔100μL，37℃反应1.5h，倾倒孔内液体，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液；(5)加酶标二抗：加入羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记抗体，每孔100μL，37℃反应1h，倾倒孔内液体，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液；(6)显色：加入新鲜预混的TMB双组分显色液，每孔100μL，37℃反应10min；(7)终止反应：每孔加入50μL终止液终止反应；(8)吸光值测定：采用双波长测定各孔的OD450和OD620值，实际OD＝OD450-OD620。其中，所述待测样品为牛乳、奶粉、乳清蛋白粉和水解乳清蛋白粉中的一种或多种。待测样品的预处理方法为：对于液体样品：(1)脱脂：将待测样品用4层消毒纱布过滤，去除固体杂质，随后用4℃冷冻离心机2500g转速，10min脱脂，得到脱脂乳；(2)去除酪蛋白：采用等电点沉淀法，将脱脂乳用1mol/L盐酸调其pH至4.6，10min中后使用4℃冷冻离心机2500g转速，15min收集上清液，得到乳清；(3)去除乳糖及矿物质：将得到的乳清在70℃中预热30min，采用超滤技术截留乳糖以及矿物质成分，得到脱除乳糖的乳清，4℃以下保存待测。对于固体样品：取1g样品于50mlPBS溶液中，剧烈震荡5min混匀备用，待测时需稀释到一定倍数检测。与现有技术相比，本专利技术的技术效果：本专利技术针对β-乳球蛋白和a-乳白蛋白这两种过敏原，提供一种间接竞争酶联免疫的检测方法，突破传统仅检测单一过敏原的模式，达到同时检测两种抗原性的效果，并且检测限低可达10ng/ml，具有快速灵敏和省时省力多种特点，同时也可以在本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.同时检测乳制品中β‑乳球蛋白和a‑乳白蛋白两种过敏原的方法，其特征在于，将β‑乳球蛋白和α‑乳白蛋白标准品等量混合作为包被抗原，抗β‑乳球蛋白抗体和α‑乳白蛋白抗体等量混合成混合抗血清作为一抗，采用间接竞争酶联免疫法同时检测两种过敏原的抗原性，其中，抗原包被的质量浓度为0.2～10.0μg/ml，混合抗血清的稀释度为1:4000～16000。
【技术特征摘要】
1.同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其特征在于，将β-乳球蛋白和α-乳白蛋白标准品等量混合作为包被抗原，抗β-乳球蛋白抗体和α-乳白蛋白抗体等量混合成混合抗血清作为一抗，采用间接竞争酶联免疫法同时检测两种过敏原的抗原性，其中，抗原包被的质量浓度为0.2～10.0μg/ml，混合抗血清的稀释度为1:4000～16000。2.根据权利要求1所述的同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其特征在于，抗原包被的质量浓度为0.5～5.0μg/ml，混合抗血清的稀释度为1:8000～12000。3.根据权利要求2所述的同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其特征在于，抗原包被的质量浓度为5.0μg/ml，混合抗血清的稀释度为12000。4.根据权利要求1所述的同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其特征在于，酶标二抗采用羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记抗体，其稀释浓度为1:5000～1:40000。5.根据权利要求4所述的同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其特征在于，酶标二抗采用羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记抗体，其稀释浓度为1:10000。6.根据权利要求1-5任一项所述的同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其特征在于，包括以下步骤：标准曲线的建立、样品吸光值测定、以及根据标准曲线计算得到牛乳中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的浓度。7.根据权利要求6所述的同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其特征在于，标准曲线的建立方法为：(1)抗原包被：将包被抗原稀释到所述的质量浓度，每孔100μL包被酶标板，37℃包被2h；(2)洗涤：倾倒孔内液体，PBST震荡洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液；(3)封闭：按每孔100μL加入封闭液，37℃封闭1h，弃封闭液，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液；(4)竞争结合：用PBS稀释β-乳球蛋白和a-乳白蛋白混合标准品，做0.1ng/ml～1000ng/ml梯度稀释，并与所述的稀释度的混合抗血清预混，预混液每孔100μL，37℃反应1.5h，倾倒孔内液体，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液；(5)加酶标二抗：加入羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记抗体，每孔100μL，37℃反应1h，倾倒孔内液体，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液；(6)显色：加入新鲜预混的TMB双组分显色液，每孔100μL，37℃反应10min；(7)终止反应：每孔加入50μL终止液终止反应；(8)吸光值测定：采用双波长测定...
【专利技术属性】
技术研发人员：李书国，王佳蕊，郝雅茹，齐慧丽，
申请(专利权)人：河北科技大学，
类型：发明
国别省市：河北,13
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