一种检测黄曲霉毒素B1的比率电化学生物传感器的制备方法技术

本发明专利技术属于生物传感器技术领域，具体涉及一种检测黄曲霉毒素B1的比率电化学生物传感器的制备方法。硫堇THI与还原氧化石墨烯rGO复合材料作为信标分子一，AFB1适配体携带的二茂铁作为信标分子二，带正电的壳聚糖通过静电吸附作用将两者连接并固定在玻碳电极表面。本发明专利技术中，引入AFB1适配体，提高了比率生物传感器毒素AFB1的高特异性；构思在适配体两端标记Fc信号，实现了对比率信号的放大。构筑的比率电化学生物传感器检测线性范围为0.01ng·mL

Preparation of a ratio electrochemical biosensor for aflatoxin B1 detection

【技术实现步骤摘要】
一种检测黄曲霉毒素B1的比率电化学生物传感器的制备方法
本专利技术属于生物传感器
，具体涉及一种基于静电作用的比率电化学生物传感器制备方法及其应用，可用于对真菌毒素黄曲霉毒素B1(AFB1)检测。
技术介绍
真菌毒素是由某些真菌产生的毒性次生代谢产物。在所有真菌毒素中，AFB1毒性最强，对人类健康构成严重威胁(致癌物、致畸物和致突变物)，已被国际癌症研究机构(IARC)列为第一批人类致癌物。AFB1容易在花生、玉米、小麦等农作物中产生，所以为了保护消费者的健康和防止食品安全问题，欧盟委员会规定粮食中的AFB1最高含量为2μg/kg。目前，AFB1现有的检测方法各有其优缺点。例如，高效液相色谱与质谱联用和薄层色谱法具有较高的准确度，但是，操作繁琐、成本高。然而，电化学发光、光电化学和电化学方法在操作方法、检测特异性和应用范围等方面都有明显的优势。电化学法具有灵敏度高、选择性好、操作简单、成本低、小型化等优点，引起了研究者的广泛关注。但是，单信号电化学容易受到干扰因素如环境条件、复杂的操作、缓慢的电子转移动力学等影响，产生假阳性或假阴性信号。因此，开发一种高效、灵敏的电化学传感平台是很有必要的。双信号输出模式的比率电化学检测技术具有固有的内置校正，可用于消除系统固有的背景电化学信号的影响，由于其具有较高灵敏度、优异的选择性、良好的可靠性和再现性，已经被广泛研究。目前，大多数比率生物传感器的研究利用二茂铁(Fc)和亚甲基蓝(MB)等电化学信号标记DNA分子，还未有文献报道在裸玻碳电极表面修饰无标签信号分子作为稳定信号，引入DNA链携带的另一个电化学分子来获得高灵敏度比率电化学生物传感器。
技术实现思路
本文旨在专利技术一种集高稳定性、高选择性、高灵敏度、低干扰等优点为一体的比率电化学生物传感器直接检测AFB1。我们提出了一种新型比率电化学传感器的构建方法，实现对AFB1的检测。本专利技术介绍了一种无标记比率信号分子硫堇与还原氧化石墨烯(THI-rGO)复合材料，其通过硫堇(THI)和还原石墨烯氧化物(rGO)的非共价结合形成。通过静电吸附作用将壳聚糖固定在电极表面，在3’末端和5’末端携带比率信号分子Fc的适配体通过与壳聚糖的静电作用而固定在被修饰的电极表面。获得新型比率电化学生物传感器，用于对实际样品灵敏、快速的分析。本专利技术通过如下技术方案实现：一种电位选择比率光电化学生物传感器构建的方法，步骤如下：(1)THI-rGO复合材料的制备：首先，分别将THI、rGO用超纯水溶解并室温保存，THI需要避光；然后用细胞粉碎机处理rGO，提高其在水中的分散性；最后，将THI溶液与处理的rGO分散液混合搅拌并离心水洗，得到THI-rGO复合材料，室温储存备用；(2)将玻碳电极依次用不同粒径的三氧化二铝粉末打磨，在乙醇和水中超声后于空气中干燥；(3)将步骤(1)制备的THI-rGO复合材料修饰到步骤(2)所制得的玻碳电极表面，并在室温下自然晾干；记为THI-rGO/GCE；(4)将壳聚糖修饰在步骤(3)所制得的传感器表面，并在室温下自然晾干；传感器表面形成一层膜结构，记为CS/THI-rGO/GCE；(5)将AFB1适配体修饰在步骤(4)所获得的传感器表面，壳聚糖与AFB1适配体之间的静电吸附作用使AFB1适配体被固定在电极表面，从而获得高灵敏比率电化学生物传感器，记为APT/CS/THI-rGO/GCE。步骤(1)中，THI的浓度为5μg·mL-1，rGO浓度为0.1mg·mL-1，细胞粉碎机处理rGO时间为30min，两个材料混合搅拌时间为12h，离心水洗三次，离心转速为8000rpm，每次15min，最终得到沉淀溶解在超纯水中；THI溶液：rGO分散液的体积比为1:3。步骤(2)中，玻碳电极的直径d＝3mm；所用的三氧化二铝粉末的粒径依次为0.3μm、0.05μm。步骤(3)中，THI-rGO复合材料的用量为6μL。步骤(4)中，壳聚糖的浓度为0.5wt％，pH为5.0，用量为8μL。步骤(5)中，AFB1的适配体浓度所用量为1.0-3.0μM，用量为6μL；反应温度为4℃，反应时间为6-14h。在上述所制得的生物传感器表面依次修饰不同浓度的AFB1溶液，室温下绑定时间为0.4-1.6h，AFB1浓度依次为0.01ng·mL-1,0.05ng·mL-1,0.1ng·mL-1,0.5ng·mL-1,5ng·mL-1,20ng·mL-1,100ng·mL-1，之后用Tris-HCl(pH＝7.4)溶液对电极进行清洗。制得的传感器作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，由型号为CHI750E的电化学工作站记录与检测电化学信号。在0.1MPBS(pH＝7.0)缓冲溶液中进行测试。扫描电压范围-0.4-0.7V，振幅为0.025V，频率为25Hz。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术的比率电化学生物传感器可同时获得两个检测信号，信息量大，精准度、可信度高。(2)本专利技术将一个比率信号分子修饰在电极表面，作为传感器的内标分子，提高了传感器的准确度。(3)本专利技术在适配体两端修饰比率分子，实现比率信号的放大，解决了DNA链携带信号分子电化学信号小的难题。(4)本专利技术引入特异性识别元件AFB1的适配体，提高了比率生物传感器的选择性，降低了与AFB1同时存在毒素的干扰，实现对AFB1的特异性分析。(5)本专利技术构建的比率电化学生物传感器用于AFB1的检测，灵敏度高、选择性好、稳定性好，线性范围宽,为0.01-100ng·mL-1。附图说明图1为比率电化学生物传感器构建过程图。图2(A)为AFB1适配体孵育时间与IFc关系图；(B)为目标物孵育时间与IFc关系图。图3(A)为rGO的SEM图；(B)复合材料THI-rGO的SEM图；(C)rGO的TEM图；(D)复合材料THI-rGO的SEM图。图4(A)不同浓度AFB1所对应的电化学信号ITHI与IFc的变化：a-g浓度依次为0.01,0.05,0.1,0.5,5,20,100ng·mL-1；(B)不同浓度AFB1对数与电化学信号ITHI/IFc之间构建的线性关系。图5(A)不同电极之间的比率生物传感器的重现性，(B)适配体传感器连续放置7天的稳定性能。图6比率生物传感器的选择性。干扰物分别为伏马菌素；黄曲霉毒素B2；玉米赤霉烯酮；赭曲霉毒素A。具体实施方式：实施例1按照图1所述的的制备工艺流程，比率电化学生物传感器的制备方法包括以下步骤：(1)THI-rGO复合材料的制备：首先，称量1mgTHI用超纯水溶解，得到50mL浓度为20μg·mL-1的THI溶液，并逐级稀释至5μg·mL-1，避光室温储存；称量3mgrGO并分散在30mL超纯水中从而得到浓度为0.1mg·mL-1的rGO分散溶液，利用细胞粉碎机处理分散液30min并置于室温储存待用。然后，取3mL5μg·mL-1的THI与15mL0.1mg·mL-1的rGO在100mL的烧杯中混合并搅拌12h，搅拌结束，将溶液置于10mL离心管，在转速为8000rpm，离心时间为15min条件下，离心水洗三次，得到沉淀最后，将所得沉淀溶解在3mL超纯水中，室温保存备用。(2)将玻碳电极(d＝3mmGCE)依次用0.3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测黄曲霉毒素B1比率电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：(1)THI‑rGO复合材料的制备：首先，分别将THI、rGO用超纯水溶解并室温保存，THI需要避光；然后用细胞粉碎机处理rGO，提高其在水中的分散性；最后，将THI溶液与处理的rGO分散液混合搅拌并离心水洗，得到THI‑rGO复合材料，室温储存备用；(2)将玻碳电极依次用不同粒径的三氧化二铝粉末打磨，在乙醇和水中超声后于空气中干燥；(3)将步骤(1)制备的THI‑rGO复合材料修饰到步骤(2)所制得的玻碳电极表面，并在室温下自然晾干；(4)将壳聚糖修饰在步骤(3)所制得的传感器表面，并在室温下自然晾干；(5)将AFB1适配体修饰在步骤(4)所获得的传感器表面，壳聚糖与AFB1适配体之间的静电吸附作用使AFB1适配体被固定在电极表面，从而获得高灵敏比率电化学生物传感器。

【技术特征摘要】
1.一种检测黄曲霉毒素B1比率电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：(1)THI-rGO复合材料的制备：首先，分别将THI、rGO用超纯水溶解并室温保存，THI需要避光；然后用细胞粉碎机处理rGO，提高其在水中的分散性；最后，将THI溶液与处理的rGO分散液混合搅拌并离心水洗，得到THI-rGO复合材料，室温储存备用；(2)将玻碳电极依次用不同粒径的三氧化二铝粉末打磨，在乙醇和水中超声后于空气中干燥；(3)将步骤(1)制备的THI-rGO复合材料修饰到步骤(2)所制得的玻碳电极表面，并在室温下自然晾干；(4)将壳聚糖修饰在步骤(3)所制得的传感器表面，并在室温下自然晾干；(5)将AFB1适配体修饰在步骤(4)所获得的传感器表面，壳聚糖与AFB1适配体之间的静电吸附作用使AFB1适配体被固定在电极表面，从而获得高灵敏比率电化学生物传感器。2.根据权利要求1所述的检测黄曲霉毒素B1比率电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，THI的浓度为5μg·mL-1，rGO...

【专利技术属性】
技术研发人员：由天艳，李玉叶，刘东，朱成喜，申秀丽，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32