快速检测鲤浮肿病毒的RAA扩增引物和探针及检测试剂盒与使用方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测鲤浮肿病毒的RAA扩增引物和探针及检测试剂盒与使用方法。本发明专利技术的RAA等温扩增体系，反应快速，温度范围宽，在34～40℃条件下均可实现靶基因的有效扩增，其最低检出限为6.14×10°拷贝/μL，灵敏度与CEV的TaqMan荧光定量PCR相当，且不与其他水生动物疫病发生交叉反应。本发明专利技术的试剂盒能快捷、高效、灵敏的检测鲤浮肿病毒，具有操作简单，特异性高，且反应结果易于观察，安全无污染等特点，不仅为鲤浮肿病毒感染核酸的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，同时对于控制鲤浮肿病毒在中国鲤和锦鲤感染传播及在疫区、出入境口岸的检验检疫也具有非常重要的意义。

RAA Amplified Primers and Probes for Rapid Detection of Cyprinus carpio Edema Virus

【技术实现步骤摘要】
快速检测鲤浮肿病毒的RAA扩增引物和探针及检测试剂盒与使用方法
本专利技术涉及水产养殖业水生动物疫病领域，尤其是一种快速检测鲤浮肿病毒的RAA扩增引物和探针及检测试剂盒与使用方法。
技术介绍
鲤浮肿病(Carpedemavirusdisease，CEVD)，也称锦鲤昏睡病(koisleepydisease,KSD)，是由一种痘病毒鲤浮肿病毒(Carpedemavirus，CEV)感染鲤、锦鲤引起的高度传染性流行病。患病鱼常出现烂鳃、凹眼、昏睡等症状，疾病导致的死亡率高达80-100％，给水产养殖业造成严重经济损失。该病已在全球迅速蔓延，我国在2016年首次报道发生CEVD，是我国水生动物的一种新发疫病。目前对CEV引起的鲤浮肿病尚无有效的治疗方法，只能以预防为主。因此建立准确、快速的现地检测方法，是有效防控CEVD的保障。由于CEV尚无易感细胞系，其检测方法主要依赖于套式PCR、荧光PCR等分子生物学方法。这些方法均需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求，难以满足非实验室等现场快速检测及基层普及应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种快速检测鲤浮肿病毒的RAA扩增引物和探针及检测试剂盒与使用方法，具有灵敏度高、特异性强、可视化、操作方法简单、无需昂贵设备等优点。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种快速检测鲤浮肿病毒的RAA扩增引物和探针，包含下述核苷酸序列的一对引物和探针：上游引物：RAA-F：5’-AGATTGTAGCATTTCCTAGTTTGTATGGCAAG-3’SEQIDNO:1下游引物：RAA-R：5’-GCTCTAGTTCTAGGATTGTATGATGAAAC-3’SEQIDNO:2探针：Probe：5’-AACTCTCTTTACTGAAACTCCTTGAGGAATTTGATCTAGAATTCCACAGAA-3’SEQIDNO:3。所述下游引物在5’端修饰Biotin。所述探针的5’端标记FAM，中间位置采用四氢呋喃THF替代一个碱基，3’端进行C3spacer处理。含有上述快速检测鲤浮肿病毒的RAA扩增引物和探针的任一项检测鲤浮肿病毒试剂盒。所述试剂盒为重组酶介导扩增试剂盒，含有上述RAA扩增引物和探针、核酸快速检测侧向流试纸条、鲤浮肿病毒P4a基因阳性对照样品和阴性对照样品、RAA干粉试剂、水解缓冲液ABuffer及醋酸镁溶液BBuffer。上述快速检测鲤浮肿病毒试剂盒的使用方法，包含以下步骤：(1)在RAA冻干酶粉中加入40.9μL水解缓冲液ABuffer，10μM、2μL鲤浮肿病毒上游引物SEQIDNO:1，10μM、2μL鲤浮肿病毒下游引物SEQIDNO:2，10μM、0.6μL鲤浮肿病毒探针SEQIDNO:3，2μL模板，在反应管盖上加280mM、2.5μL醋酸镁BBuffer，上下颠倒反应管使之充分混匀后瞬离；恒温37℃反应10min；(2)反应：将步骤(1)恒温反应后的产物用核酸快速检测试纸条检测，3-5min观察结果；(3)结果判读：直接肉眼判读①阴性：仅在质控线出现条带，在检测线处无条带出现，说明所检测的样品没有鲤浮肿病感染；②阳性：质控线和检测线均出现条带，证明所检测的样品为鲤浮肿病感染；③无效：质控线和检测线均无条带出现，表明试验不成功，核酸快速检测试纸条失效。本专利技术的有益效果是：本专利技术的RAA等温扩增体系，反应快速，温度范围宽，在34～40℃条件下均可实现靶基因的有效扩增，本专利技术的试剂盒能快捷、高效、灵敏的检测鲤浮肿病毒，具有操作简单，特异性高，且反应结果易于观察，安全无污染等特点，不仅为鲤浮肿病毒感染核酸的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，同时对于控制鲤浮肿病毒在中国鲤和锦鲤感染传播及在疫区、出入境口岸的检验检疫也具有非常重要的意义。附图说明图1为CEV的RAA检测引物筛选的凝胶结果图(1：第一组引物；2：第二组引物；3：第三组引物；4：第四组引物)；图2为RAA-LFD法对CEV的灵敏度实验图(1.阴性对照；2-10为6.14×100-6.14×108的阳性标准品的扩增结果)；图3是本专利技术引物特异性测试图(1：阴性对照；2：鲤浮肿病毒P4a基因阳性质粒对照；3：锦鲤疱疹病毒(KHV)核酸；4：金鱼造血器官坏死病毒(GFHNV)核酸；5：流行性造血器官坏死病毒(EHNV)核酸；6：蛙虹彩病毒(BIV)核酸；7：斑点叉尾鮰病毒(CCV)核酸；8:对虾白斑综合征病毒(WSSV)核酸；9:虾肝肠胞虫(EHP)核酸)。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明：以下实施例中所用的材料、试剂等，无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实例中RAA扩增试剂盒购自杭州众测生物科技有限公司。以下实例中便携式核酸快速检测侧向流试纸条(LFD)为杭州优思达生物技术有限公司产品。以下实例中病毒基因组DNA提取试剂盒购自QIAGEN公司。以下实例中的引物及探针均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以下实施例中的鲤浮肿病毒P4a基因阳性质粒根据GenBank公布的P4a序列(528bp)进行合成并克隆在pEASY-T1载体，作为本专利技术试剂盒的标准品。实施例1鲤浮肿病毒的RAA-LFD快速检测试剂盒的建立1.鲤浮肿病毒的RAA引物及探针的设计及合成以NCBI数据库中CEVP4a基因保守区域为靶位点，依据RAA引物设计原则，采用DNAman6.0软件进行序列比对分析，选取同源性高的片段，用primerprimer5.0设计了4对引物(如表1)。表1RAA所用的引物：2.CEVRAA检测引物筛选以CEV阳性质粒(6.14×106copies/μL)为模板进行扩增，反应结束后，用2％的琼脂糖电泳鉴定(见图1)，对设计引物进行筛选，筛选出最优引物对为第二组引物，其最优引物对为F及R：上游引物：CEV-2-F：5’-AGATTGTAGCATTTCCTAGTTTGTATGGCAAG-3’SEQIDNO:1下游引物：CEV-2-R:5’-GCTCTAGTTCTAGGATTGTATGATGAAAC-3’SEQIDNO:23.CEVRAA-LFD试剂盒的建立本专利技术所述的CEVRAA-LFD试剂盒包括核酸检测试剂盒和核酸快速检测侧向流试纸条。本专利技术所述的核酸检测试剂盒，包括引物混合液、特异性探针、ABuffer、BBuffer、RAA干粉试剂、鲤浮肿病毒标准品和阴性样品。其中，所述的ABuffer为20％PEG；BBuffer为280mMMgAc；RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/LdNTP、90ng/μLSSB蛋白、120ng/μLrecA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μLRad51、30ng/μLBsuDNA聚合酶，100mmol/LTricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、nfo核酸外切酶、30ng/μLRTE逆转录酶。本专利技术所述的引物混合液中，所述的上游引物碱基序列如SEQIDNO:1所示，所述下游引物的碱基序列SEQIDNO:2所示，上游引物和下游引物的摩尔配比为1:1。其中下游引物在5’端修饰Bio本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测鲤浮肿病毒的RAA扩增引物和探针，其特征在于，包含下述核苷酸序列的一对引物和探针：上游引物：RAA‑F：5’‑AGATTGTAGCATTTCCTAGTTTGTATGGCAAG‑3’SEQ ID NO:1下游引物：RAA‑R：5’‑GCTCTAGTTCTAGGATTGTATGATGAAAC‑3’SEQ ID NO:2探针：Probe：5’‑AACTCTCTTTACTGAAACTCCTTGAGGAATTTGATCTAGAATTCCACAGAA‑3’SEQ ID NO:3。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测鲤浮肿病毒的RAA扩增引物和探针，其特征在于，包含下述核苷酸序列的一对引物和探针：上游引物：RAA-F：5’-AGATTGTAGCATTTCCTAGTTTGTATGGCAAG-3’SEQIDNO:1下游引物：RAA-R：5’-GCTCTAGTTCTAGGATTGTATGATGAAAC-3’SEQIDNO:2探针：Probe：5’-AACTCTCTTTACTGAAACTCCTTGAGGAATTTGATCTAGAATTCCACAGAA-3’SEQIDNO:3。2.根据权利要求1所述快速检测鲤浮肿病毒的RAA扩增引物和探针，其特征在于，所述下游引物在5’端修饰Biotin。3.根据权利要求1所述快速检测鲤浮肿病毒的RAA扩增引物和探针，其特征在于，所述探针的5’端标记FAM，中间位置采用四氢呋喃THF替代一个碱基，3’端进行C3spacer处理。4.含有权利要求1-3任一项所述快速检测鲤浮肿病毒的RAA扩增引物和探针的快速检测鲤浮肿病毒试剂盒。5.根据权利要求4所述快速检测鲤浮肿病毒试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为重组酶介导扩增试剂盒，含有权...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕晓楠，徐立蒲，张文，曹欢，王小亮，王姝，王静波，
申请(专利权)人：北京市水产技术推广站，
类型：发明
国别省市：北京,11