一种皮肤内源性老化靶标的筛选方法及改善皮肤内源性老化的活性物及其筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种皮肤内源性老化靶标的筛选方法及改善皮肤内源性老化的活性物及其筛选方法，以皮肤中的microRNA为检测依据，所述microRNA为hsa‑miR‑30c‑2‑3p和hsa‑miR‑125b‑1‑3p中的任意一种或两种的组合。所述microRNA具有抑制IGF1基因和IGF1R基因表达的作用，进而影响皮肤的内源性老化。本发明专利技术为开发改善皮肤内源性老化的化妆品活性成分提供了新的调控靶标。

A Screening Method for Endogenous Aging Targets of Skin and Active Substances for Improving Endogenous Aging of Skin and Their Screening Method

【技术实现步骤摘要】
一种皮肤内源性老化靶标的筛选方法及改善皮肤内源性老化的活性物及其筛选方法
本专利技术属于生物
，具体地，本专利技术涉及一种皮肤内源性老化靶标的筛选方法、用靶标筛选活性物的方法以及改善皮肤内源性老化的活性物。
技术介绍
当今社会人们普遍对于自身的皮肤状况日趋关注，希望能通过护肤品维持健康年轻的状态，在此期望之上产生了解决不同皮肤问题的细分化类型产品。随着时间的流逝，每个消费者都会面临皮肤的老化问题，因此抗老化护肤品一直在化妆品的各大门类中占有重要地位。皮肤的老化分为外源性老化和内源性老化，外源性老化指由外界影响因素导致的老化，如紫外线照射、吸烟、环境污染等因素；内源性老化指由人体基因程序性变化所引起的老化。虽然内源性老化的结局不可避免，但化妆品的日常持续使用仍可在一定程度上延缓皮肤的衰老，改善皮肤内源性老化的进程。随着近年来表观遗传学研究的不断深入，人们对人体基因表达的方式有了新的认识。人体的各种生理病理状况并不是单纯由基因决定的，表观遗传因素同样可以改变基因表达与否的指令并且让这套指令稳定遗传下去。表观遗传学的主要机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA等，其中非编码RNA具有非常重要且多样的调节功能，因此在分子生物学、细胞生物学和生理学领域都受到了高度的关注，具有极高的研究价值。本专利技术关注的是一种近年来受到重点关注的被称为microRNA(微小RNA)的非编码RNA。microRNA发现于1993年，是一种内生的小片段RNA，其涉及被RNA干扰：它们能够靶向信使RNA(mRNA)并导致其降解或终止其翻译。像这样的微小RNA因而在细胞中起着非常重要的调控作用。而且，它们形成最大种类的调节分子当中的一群。它们是内源性的，来源于由基因组编码的初级微小RNA(pri-miRNA)。迄今为止，已鉴定了大约700种人微小RNA。它们的功能和靶标还没有得到完整的解释或证实。microRNA是普遍存在于生物体内的一类小分子，长度为17-27个核苷酸，可以通过与互补的mRNA靶点结合而特异性地抑制目标基因的表达。研究显示数以千计的人类蛋白编码基因受到microRNA的调控，表明microRNA是许多重要生物过程的“主调节器”。microRNA的命名是以其被发现的时间顺序为依据的，以hsa-miR-30c-2-3p为例：hsa表示的是该分子所属的物种是人类，miR是成熟体microRNA的标识，30则是该microRNA所属家族成员被发现或者被提交公共数据库时按照顺序被给予的一个流水号，“c”、“-2”“-3p”则分别指代产生该成熟体microRNA的前体序列、基因组位置、前体3’端臂的编号。目前对于皮肤miRNAs的研究寥寥无几，尤其是对人的皮肤。在动物皮肤上，最初是在小鼠，已经克隆了表达的miRNAs。它们对于表皮和皮毛的形态建成起着重要作用。近年来，发现miRNAs与山羊和绵羊的皮毛增长有关。最近，在小鼠的皮肤中，miRNA中的miR203已被鉴定，其在表皮分化诱导中通过降低细胞增殖潜力发挥着重要作用。在人体中，有研究将正常皮肤与牛皮癣皮肤和湿疹皮肤中的miRNAs的表达进行了比较。miRNA中的miR203在皮肤中高表达(相对于其它器官)而且仅通过角质形成细胞表达。它已被证实是属于在牛皮癣皮肤中过表达的一种miRNA。目前关于皮肤的microRNA研究多数集中在重大皮肤疾病的诊治方面，关于皮肤内源性老化的研究非常有限，本专利技术是通过采集大量不同年龄段的正常人体皮肤样本，使用高通量人源microRNA芯片测试皮肤microRNA表达谱，筛选归纳后得到具有显著差异的microRNA分子。在对具有显著差异的microRNA分子的作用机理的分析中，利用miRWalk2.0数据库的“ValidatedTargetModule”模块可预测microRNA分子的靶标基因集，并利用生物信息数据库DAVIDv6.8对靶标基因集进行功能和代谢通路富集分析，根据靶标基因在皮肤老化功能中的权重可得到起关键作用的microRNA分子，即皮肤内源性老化的microRNA标志物。最后可通过RT-PCR实验来验证microRNA标志物与预测靶标基因的关联作用。microRNA标志物的发现可用于建立体外生物模型，根据microRNA标志物的表达量检验化学物质的生物学功效，并应用于化妆品活性成分的开发中。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种开发改善皮肤内源性老化的活性物的方法，该方法以皮肤内源性老化的microRNA标志物为检测依据，从而为改善皮肤内源性老化的化妆品开发新颖的活性功效成分。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：采集大量不同年龄段的正常人体皮肤样本，使用高通量人源microRNA芯片测试microRNA表达谱。比较不同年龄段皮肤microRNA表达谱的差异，筛选归纳后得到皮肤内源性老化的microRNA标志物。所述皮肤内源性老化的microRNA标志物，其特征在于，所述标志物为hsa-miR-30c-2-3p和hsa-miR-125b-1-3p中的任意一种或两种的组合。所述hsa-miR-30c-2-3p序列为SEQIDNO.1所示，所述hsa-miR-125b-1-3p序列为SEQIDNO.2所示，其中，SEQIDNO.1CUGGGAGAAGGCUGUUUACUCUSEQIDNO.2ACGGGUUAGGCUCUUGGGAGCU根据生物信息学分析结果，所述标志物以皮肤中的IGF1基因和IGF1R基因为共同靶标。所述标志物经RT-PCR检验与皮肤中IGF1基因和IGF1R基因的表达有关联性。所述IGF1基因(EntrezID:3479)和IGF1R基因(EntrezID:3480)的编码产物分别为IGF-1(1型胰岛素样生长因子)和IGF-1R(1型胰岛素样生长因子受体)。IGF-1和IGF-1R之间具有极高的亲和性，在正常人体细胞内，两者的结合能激活许多信号通路，如长寿调节通路(KEGGpathwayID:hsa04211)、Fox0信号通路(KEGGpathwayID:hsa04068)，对细胞的生长和更新具有促进作用。所述标志物用于开发改善皮肤老化的化妆品活性成分。具体地，构建三维重组人体皮肤模型并进行体外培养，使用待检测的活性物处理重组皮肤模型；待培养结束后收获皮肤模型样本，以所述标志物为靶标进行microRNART-PCR的半定量检测，对所述标志物具有显著下调作用(P<0.05)的活性物即可用于开发改善皮肤老化的化妆品。本专利技术与现有技术相比显著的优点是：本专利技术首次将microRNA芯片技术与内源性老化皮肤microRNA的表达联合考察，筛选出皮肤内源性老化的microRNA标志物，以该标志物为靶标的活性物功效检测方法具有高效、特异性高、灵敏度高的优点，适用于改善皮肤内源性老化的化妆品活性成分的开发。具体地，本专利技术涉及一种皮肤内源性老化靶标的筛选方法，包含以下步骤：步骤1：收集复数个皮肤样本，按照老化程度进行分组；步骤2：对所述复数个皮肤样本进行总RNA抽提；步骤3：将总RNA抽提样品与人microRNA芯片杂交；步骤4：扫描所述芯片，数据处理得到microRNA表达谱；步骤5：数据处理获得差异化mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种皮肤内源性老化靶标的筛选方法，其特征在于，包含以下步骤：步骤1：收集复数个皮肤样本，按照老化程度进行分组；步骤2：对所述复数个皮肤样本进行总RNA抽提；步骤3：将总RNA抽提样品与人microRNA芯片杂交；步骤4：扫描所述芯片，数据处理得到microRNA表达谱；步骤5：数据处理获得差异化microRNA；步骤6：对所述差异化microRNA的靶标基因集进行功能和代谢通路富集分析。

【技术特征摘要】
1.一种皮肤内源性老化靶标的筛选方法，其特征在于，包含以下步骤：步骤1：收集复数个皮肤样本，按照老化程度进行分组；步骤2：对所述复数个皮肤样本进行总RNA抽提；步骤3：将总RNA抽提样品与人microRNA芯片杂交；步骤4：扫描所述芯片，数据处理得到microRNA表达谱；步骤5：数据处理获得差异化microRNA；步骤6：对所述差异化microRNA的靶标基因集进行功能和代谢通路富集分析。2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述差异化microRNA以皮肤细胞中的IGF1基因和/或IGF1R基因为共同靶标的microRNA或microRNAs为标志物。3.根据权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于，所述差异化microRNA选自皮肤细胞中的hsa-miR-30c-2-3p和hsa-miR-125b-1-3p中的一种或多种。4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述皮肤细胞选自真皮成纤维细胞和表皮角质细胞中的一种或多种。5.一种筛选改善皮肤内源性老化的活性物的方法，其特征在于，以选自皮肤细胞中的差异化microRNA的一种或多种作为靶标。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述差异化microRNA选自皮肤细胞中的hsa-miR-30c-2-3p和hsa-miR-125b-1-3p中的一种或多种。7.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，所述差异化microRNA以皮肤细胞中的IGF1基因和/或IGF1R基因为共同靶标的microRNA或microRNAs为标志物。8.根据权利要求5～7任意一项所述的方法，其特征在于，活性物成分对皮肤细胞所述靶...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋丹丹，摩根·多斯桑托斯，李慧，
申请(专利权)人：伽蓝集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31