烟草热激蛋白HSP22及其应用制造技术

本发明专利技术属于烟草基因工程领域，具体涉及烟草热激蛋白HSP 22基因及其应用专利申请。该基因碱基序列如SEQ ID NO.1所示。烟草热激蛋白HSP 22由192个氨基酸残基组成，其中第68‑159位氨基酸保守的SHSP结构域。该蛋白与植物叶片中色素类物质含量相关，降低该蛋白表达后，叶片中色素类物质含量明显降低，所述色素类物质为：新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a/b、β‑胡萝卜素。本发明专利技术通过对特定烟草热激蛋白HSP 22的初步研究，发现其与烟草色素类物质含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草中色素类物质含量发生了明显降低。基于这一特性，可为烟草新品种培育一定的应用基础和参考借鉴。

Tobacco heat shock protein HSP22 and its application

【技术实现步骤摘要】
烟草热激蛋白HSP22及其应用
本专利技术属于烟草基因工程领域，具体涉及烟草热激蛋白HSP22及其应用专利申请。
技术介绍
人们通常所吸食的烟草属双子叶植物纲管花目茄科烟草属植物，烟草属(Nicotiana)有60多个种，而用于制备所吸食的烟草主要为两个栽培种，分别为普通烟草(又称红花烟草，Nicotianatabacum)和黄花烟草(Nicotianarustica)，其中前者占据主要面积，而后者的栽培面积相对较小。栽培烟草按烟叶品质特点、生物学性状和栽培调制方法等特点可分为烤烟、晒烟、晾烟、白肋烟、香料烟和黄花烟六个类型，其中烤烟是栽培最广的普通烟草。我国烤烟种植面积和总产量均居世界第一位。作为一种叶用经济作物，烤烟的栽培技术有别于其它大田作物，不仅要求有一定的烟叶产量，而且更注重烟叶品质。烟叶品质决定烟叶的可用性，直接影响卷烟商品的色、香、味和商品价值，也关系到烟农的经济效益，是烟草行业的生命和出发点。为使在未来的国内外市场竞争中立于不败之地，满足国内外卷烟企业对优质烟叶不断增长的需求，必须提高烟叶品质和安全性。植物色素是烟草中一类重要的化合物，主要包括叶绿素和类胡罗卜素类物质。叶绿素在烟草成熟和烟叶调制过程中大量降解消失，它在干烟叶中是一种不利的化学成分，往往带有青杂气，是烟叶分级中被严格控制的指标之一。如果叶绿素在调制处理过程中没有充分降解就把烟叶烤干，就会烤出不同程度的“青黄烟”。“青黄烟”不仅外观品质不良，燃烧时还会产生有害物质，进而影响烟草等级和品质。烟叶发酵醇化过程中，叶绿素卟啉环一方面会降解产生吡咯类化合物，从而增加烟叶陈化香，降低青杂气；另一方面，叶绿素水解产生的植醇可进一步降解成新植二烯，并再降解成植物呋喃，进而转化成烟叶的清甜成分。因此，叶绿素是重要的香气前体物，充分降解后对烟质较为有利。烟草黄色素主要是类胡萝卜素，烟叶类胡萝卜素含量与烟叶品质存在正相关关系，一方面是烟叶外观品质与该类成分含量直接相关；另一方面类胡萝卜素是烟草香气成分的重要前体物质，对烟草的香气量和香气品质是正相关关系。烟叶中的香味成分很大一部分是类胡萝卜素的降解产物，其中不少化合物是烟草中关键的致香成分，如紫罗兰酮、大马酮和异佛尔酮等。基于上述烟叶中色素的重要作用，对烟草色素类物质调控基因进行深入研究，利用基因工程构建新的烟草品种，可为改善烟草品种奠定良好应用基础。
技术实现思路
基于烟草色素类物质含量调控基因的研究，本专利技术目的在于提供一种烟草热激蛋白HSP22基因及其在烟草色素物质含量调节方面的应用，从而为烟草新品种培育奠定基础。本申请所采取的技术方案详述如下。烟草热激蛋白HSP22的编码基因HSP22，其碱基序列如SEQIDNO.1所示，其中特异性核酸片段为202-477位碱基。所述编码HSP22基因在叶片色素类物质含量调控中的应用，利用基因沉默技术、或者基因超表达方法，通过调节烟草HSP22蛋白表达量，来调节控制烟叶中色素类物质含量情况，所述色素类物质为：新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a/b、β-胡萝卜素。烟草热激蛋白HSP22，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，其由192个氨基酸残基组成，其中第68-159位氨基酸保守的SHSP结构域。所述烟草热激蛋白HSP22在叶片色素类物质含量调控中的应用，该蛋白与植物叶片中色素类物质含量相关，降低该蛋白表达后，叶片中色素类物质含量明显降低，所述色素类物质为：新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a/b、β-胡萝卜素。利用所述编码基因HSP22的烟草新品种培育方法，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有HSP22基因的病毒诱导沉默载体、RNAi干涉载体、超表达载体或基因组编辑载体，转化烟草，筛选获得色素含量变化的烟草新品种；具体例如：利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，干扰HSP22基因的表达使其沉默，HSP22基因沉默植株中色素类物质含量显著下降，进而获得色素含量下降的植物新品种。本专利技术通过对特定烟草热激蛋白HSP22的初步研究，发现其与烟草色素类物质含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草中色素类物质含量发生了明显降低。基于这一特性，可为烟草新品种培育一定的应用基础和参考借鉴。附图说明图1为本专利技术烟草TRV2-PDS、TRV2-GFP及TRV2-NtHSP22载体转化组的表型对比图；图2为与对照植株相比NtHSP22基因沉默植株中该基因的相对表达量；图3为病毒诱导基因沉默的烟叶及对照烟叶中的主要色素含量比较。具体实施方式下面结合实施例对本申请做进一步解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中具体实验背景资料情况简要介绍如下。生物材料：本氏烟草，一种常用烟草材料，下述实施例中烟草种植于郑州烟草院种植基地，育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵（10cm×10cm）中，22℃、16h光/8h暗条件下进行日常肥水管理等；下述实施例中所采用的VIGS载体是一种来自烟草脆裂病毒的病毒载体（tobaccorattlevirus，TRV)，所具体利用的TRV2由郑州烟草研究院基因中心保存，其带有卡那筛选标记和35S启动子，同时TRV2带有EcoRI和BamHI等多克隆位点，可以用来携带和转化外源基因；实验试剂：LB液体培养基，1L含量中含有：10g细菌蛋白胨（bacteriologicalpeptone）；10g氯化钠（NaCl）；5g酵母抽提物（yeastextract），高温高压灭菌；YEB液体培养基，1L含量中含有：5g牛肉浸膏（beefextract）；5g细菌蛋白胨（bacteriologicalpeptone）；5g蔗糖（sucrose）；1g酵母抽提物（yeastextract）；2mL1M硫酸镁（MgSO4），高温高压灭菌；1M2-(N-吗啉)乙磺酸（MES）储备液：ddH2O溶解，过滤灭菌，-20℃储存备用；200mM乙酰丁香酮（Acetosyringone，As）储备液：二甲基亚砜（DSMO）溶解，-20℃储存备用；MMA（100mL）：1mL（1M）MgCl2；1mL（1M，pH5.6）MES；75μL（200mM）As。实施例1本实施例就烟草NtHSP22基因克隆及沉默载体的构建过程简要介绍如下。（1）烟草NtHSP22基因克隆根据前期对于烟草基因组及相关HSP22基因研究，选择特异编码序列为目标片段，设计PCR扩增用引物序列如下：NtHSP22-F：5’-ACCGAATTCGCTCAGACTGGAAGGAAACA-3’，NtHSP22-R：5’-ACCGGATCCGCTTTAATGTCCTCACCACC-3’；以烟草K326叶片的cDNA为模板，进行PCR扩增获得NtHSP22基因；PCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，34个循环后，72℃彻底延伸5min；对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收电泳产物备用。（2）构建重组TRV2-NtHSP22载体将步骤（1）中的PCR扩增产物进行EcoRI、BamHI双酶切，同时对空载体TRV2进行EcoRI、BamHI双酶切，分别回收酶切产物，利用T4DNA连接酶进行连接；将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，转化本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.烟草热激蛋白HSP22的编码基因

【技术特征摘要】
1.烟草热激蛋白HSP22的编码基因HSP22，其特征在于，其碱基序列如SEQIDNO.1所示，其中特异性核酸片段为202-477位碱基。2.权利要求1所述所述编码HSP22基因在叶片色素类物质含量调控中的应用，其特征在于，利用基因沉默技术、或者基因超表达方法，通过调节烟草HSP22蛋白表达量，来调节控制烟叶中色素类物质含量情况，所述色素类物质为：新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a/b、β-胡萝卜素。3.权利要求1所述编码基因HSP22所编码的烟草热激蛋白HSP22，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，其由192个氨基酸残基组成，其中第68-159位氨基酸保守的SHSP结构域。4.权利要求3所述烟草热激蛋白HSP22在叶片色素类物质含量调控中的应用，其特征在于，该蛋白与植物叶片中色素类物质含量相关，降低该蛋白表达后，叶片中色素类物质含量明显降低，所述色素类物质为：新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a/b、β-胡萝卜素。5.利用权利要求1所述编码...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈千思，王晨，周会娜，刘萍萍，李泽锋，郑庆霞，金静静，徐国云，魏攀，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：河南,41