甘蔗属割手密特异序列及其鉴定方法技术

本发明专利技术提供了甘蔗割手密特异序列及其分子标记，利用软件blast将甘蔗热带种LA Purple与割手密AP85‑441的DNA序列进行对比，得到6条割手密特异DNA序列，根据这6条序列分别设计引物，并用CTAB法提取2个热带种和15个割手密的基因组DNA，并用6对引物分别对基因组DNA进行PCR扩增，结果显示，这6对引物能够区分出热带种与割手密，且条带清晰明亮，本发明专利技术有利于甘蔗杂交品种鉴定研究。

Mi-specific Sequences of Sugarcane Cutting Hands and Their Identification Methods

【技术实现步骤摘要】
甘蔗属割手密特异序列及其鉴定方法
本专利技术涉及生物信息学与分子生物学领域，具体涉及甘蔗属割手密特异序列及其鉴定方法。
技术介绍
割手密是甘蔗细茎野生种，其种类丰富，分布广泛，宿根性、抗逆性强，是甘蔗育种中贡献最大的资源之一。在甘蔗育种中，种质资源基因库的基因型及有用基因的高效利用与科学管理非常关键，在提高甘蔗基因库的遗传多样性的同时，拟定针对具有不同基因型遗传背景甘蔗亲本的杂交育种计划，这对拓宽甘蔗遗传基础、扩大杂种优势有重大的现实意义。因此，割手密遗传多样性的研究对甘蔗优良品种的选育具有重要意义。分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。DNA分子标记的优越性在于在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析，表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁，检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。目前大部分甘蔗品种都是近亲繁殖，血缘相近，后代优良率极低，所选育的新品种不论在产量、糖分，还是在抗性方面都难有突破。将甘蔗近缘属的抗逆耐瘠性强、适应性广等优良性状，通过近缘属、远缘属间进行杂交应用到高贵化育种中已经势在必行。由于杂交种种类很多，其中种间杂交就包括有热带种、割手密、中国种、印度种和大茎野生种。但是现在目前还没有的方法可以快速鉴别杂交种是否含有割手密血缘，因此有必要开发快速鉴定割手密血缘的特异分子标记，将有利于割手密种质资源的开发利用。本专利技术利用割手密和热带种基因组数据进行对比分析得到了6条割手密特异序列，且根据这6条序列设计了引物，通过PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳验证，明确了这些引物仅在割手密基因组DNA中可扩增出明亮清晰的条带。
技术实现思路
本专利技术的目的是发掘甘蔗属割手密特异序列，并用于鉴别杂交种中是否含有割手密血缘，将为甘蔗等复杂多倍体植物染色体研究提供一种经济而高效的鉴定方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：甘蔗属割手密特异序列，所述序列根据割手密和热带种基因组对比数据分析得到，名称分别为：序列1C、序列2C-1、序列2C-2、序列5D、序列6D、序列7C，其核苷酸序列分别为SEQIDNO.1-7所示。所述序列1C的引物序列为：上游引物：5'GCGGATGGTTTCTCTTAGGTTC3'；下游引物：5'TAATGGCGTTAGGGAGTGGTTG3'；所述序列2C-1的引物序列为：上游引物：5'ATCACGAGAATCGGAAAGGAAT3'；下游引物：5'AGGAAGAGTGGAAGATGAAAGC3'；所述序列2C-2的引物序列为：上游引物：5'TCCAAGCCAAACCAGACAGAGC3'；下游引物：5'TAAACGCCAGCCAACTAAAACA3'；所述序列5D的引物序列为：上游引物：5'AGTTGACCTCTCGGAATCCATCG3'；下游引物：5'ACCTTGACCGTGAAAGTCTCGCC3'；所述序列6D的引物序列为：上游引物：5'CACGGGAGAAAACCAACAGGC3'；下游引物：5'TATGATTACCCACGACAAGAA3'；所述序列7C的引物序列为：上游引物：5'GATTGGCCTCTTTTGTGTTTTT3'；下游引物：5'CACGGTTCATTTCTTCTTCTCG3'。甘蔗属割手密特异序列的鉴定方法，包括如下步骤：(1)利用甘蔗属割手密和热带种基因组数据对比分析得到6条割手密特异序列；(2)将上述6条割手密特异序列进行PCR扩增，得到PCR产物；(3)将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。上述步骤(2)中，PCR扩增的条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃终延伸10min。上述步骤(2)中，所述PCR扩增反应体系为：上下游引物即F/R各为0.25μL，DNA模板2μL，Mix5μL，最后加入ddH2O将总体积补足至10μL。上述步骤(3)中，琼脂糖凝胶电泳鉴定条件为：上样后用125V电压进行电泳，15min后查看结果。结果显示割手密特异序列可区分出热带种和割手密，并得到清晰明亮的条带。本专利技术的优点在于：本专利技术利用甘蔗属割手密和热带种基因组数据对比分析得到割手密的特异序列，根据不同的序列设计相应的PCR引物，证明这些引物只能对割手密DNA进行扩增，引物特异性良好，扩增的条带单一且明亮，PCR引物为快速鉴定甘蔗杂交种中是否含有割手密血缘提供了重要工具，有利于甘蔗杂交品种鉴定研究。附图说明图1为特异序列1C对不同割手密和热带种DNA进行扩增的电泳图；图2为特异序列2C-1对不同割手密和热带种DNA进行扩增的电泳图；图3为特异序列2C-2对不同割手密和热带种DNA进行扩增的电泳图；图4为特异序列5D对不同割手密和热带种DNA进行扩增的电泳图；图5为特异序列6D对不同割手密和热带种DNA进行扩增的电泳图；图6为特异序列7C对不同割手密和热带种DNA进行扩增的电泳图；其中1泳道为LAPurple，2泳道为Badila，3泳道为AP85-441，4泳道为SES208，5泳道为崖城12号，6泳道为云南84-268，7泳道为贵州78-II-28，8泳道为四川88-16，9泳道为广东30号，10泳道为NP-X，11泳道为福建89-I-17，12泳道为云南82-106，13泳道为云南82-29，14泳道为福建87-1-4，15泳道为福建87-1-11，16泳道为福建89-1-9，17泳道为四川78-2-11，18泳道为DL5000DNAMaker；LAPurple和Badila为热带种，其余为割手密。具体实施方式实施例1：引物设计与PCR扩增甘蔗属割手密特异序列，所述序列根据割手密和热带种基因组对比数据分析得到，名称分别为：序列1C、序列2C-1、序列2C-2、序列5D、序列6D、序列7C，其核苷酸序列分别为SEQIDNO.1-7所示。所述序列1C、序列2C-1、序列2C-2、序列5D、序列6D、序列7C相应的分子标记引物序列如SEQIDNO.8-18所示。利用PrimerPremier5.0对上述6条割手密特异序列进行引物设计，引物序列如表1所示，设定条件如下：一是引物与模板序列要紧密互补；二是引物长度为18±6bp；三是引物序列的GC含量为40-60％；四是引物间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；五是引物不能在模板序列的非目的位点发生错配。表1割手密特异序列扩增引物将6条割手密特异序列进行PCR扩增，PCR扩增的条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃终延伸10min，最终得到PCR产物。实施例2：CTAB法提取DNACTAB是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，但不会沉淀核酸。再通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后，加入乙醇沉淀，即可使核酸分离出来。本专利技术所用CTAB法提取甘蔗属植物DNA技术，包括如下步骤为：(1)取新鲜甘蔗叶加入本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.甘蔗属割手密特异序列，其特征在于，所述序列根据割手密和热带种基因组数据比对分析得到割手密特异序列，名称分别为：序列1C、序列2C‑1、序列2C‑2、序列5D、序列6D、序列7C，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1‑7所示。

【技术特征摘要】
1.甘蔗属割手密特异序列，其特征在于，所述序列根据割手密和热带种基因组数据比对分析得到割手密特异序列，名称分别为：序列1C、序列2C-1、序列2C-2、序列5D、序列6D、序列7C，其核苷酸序列分别为SEQIDNO.1-7所示。2.如权利要求1所述的甘蔗属割手密特异序列，其特征在于，所述序列1C的引物序列为：上游引物：5'GCGGATGGTTTCTCTTAGGTTC3'；下游引物：5'TAATGGCGTTAGGGAGTGGTTG3'；所述序列2C-1的引物序列为：上游引物：5'ATCACGAGAATCGGAAAGGAAT3'；下游引物：5'AGGAAGAGTGGAAGATGAAAGC3'；所述序列2C-2的引物序列为：上游引物：5'TCCAAGCCAAACCAGACAGAGC3'；下游引物：5'TAAACGCCAGCCAACTAAAACA3'；所述序列5D的引物序列为：上游引物：5'AGTTGACCTCTCGGAATCCATCG3'；下游引物：5'ACCTTGACCGTGAAAGTCTCGCC3'；所述序列6D的引物序列为：上游引物：5'CACGGGAGAAAACCAACAGGC3'；下游引物：5'TATGAT...

【专利技术属性】
技术研发人员：王凯，刀乙航，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建,35