DNA依赖性蛋白激酶特异性抑制剂在制备防治肾纤维化药物中的用途制造技术

本发明专利技术属于医药领域，具体涉及一种DNA依赖性蛋白激酶特异性抑制剂在制备防治肾纤维化药物中的用途。进一步的，所述的DNA依赖性蛋白激酶活性的抑制剂为NU7441。本发明专利技术的DNA‑PK活性抑制剂是DNA‑PK催化亚基的选择性抑制剂，可减轻单侧输尿管梗阻诱导的肾小管间质纤维化，改善肾功能。NU7441通过特异性抑制DNA‑PK激活，进而抑制了mTOR的异常激活，抑制了肾小管上皮细胞上皮‑间质细胞转换，显著抑制肾小管上皮细胞和间质成纤维细胞在TGF‑β1刺激下胶原蛋白的产生，改善肾脏病理损伤和肾功能，起到改善肾小管间质纤维化作用。本发明专利技术为防治肾脏纤维化相关病症提供有效的临床药物。

Application of DNA-Dependent Protein Kinase Specific Inhibitors in the Preparation of Drugs for Preventing and Treating Renal Fibrosis

【技术实现步骤摘要】
DNA依赖性蛋白激酶特异性抑制剂在制备防治肾纤维化药物中的用途
本专利技术属于医药领域，具体涉及一种DNA依赖性蛋白激酶(DNA-dependentproteinkinase，DNA-PK)特异性抑制剂NU7441在制备防治肾纤维化相关病症药物中的用途。
技术介绍
随着社会的发展，慢性肾脏病(Chronickidneydisease，CKD)已成为全球关注的一个公共健康问题。2012年的一项调查显示，在我国，CKD的患病率约10.8％，总人数近1.2亿。由于CKD病程多呈持续性进展，最终发展至终末期肾病(end-stagerenaldisease，ESRD)，只能通过透析或肾移植进行替代性治疗。ESRD的治疗费用昂贵，统计数据显示仅在2000-2010的十年间，全球用于透析的医疗费用就高达1.1万亿美元，而透析的比例却呈逐年上升趋势，目前我国每年约有200万人需要透析治疗。ESRD不但给社会和家庭增加了沉重的负担，也给医疗卫生事业带来了巨大的挑战。然而，目前CKD的发病机制并不十分清楚，临床上也缺乏有效的特异性干预手段。大量的临床和实验研究表明，无论何种原因导致的CKD，肾脏纤维化与肾功能受损程度密切相关。肾脏纤维化是肾脏组织在各类损伤因素，如细菌、病毒、免疫性炎症、药物以及缺血缺氧等作用下而发生的器官纤维化病变，出现成纤维细胞增生及细胞间质增多，尤其是基质蛋白合成增加、基质降解受抑制导致细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)的大量堆积，进而导致肾小球硬化和小管间质的纤维化。相比肾小球硬化，肾小管间质纤维化与肾功能减退的相关性更为密切,也是决定肾脏疾病进展的主要因素。因而，延缓和改善肾脏纤维化是防治CKD的关键。DNA依赖性蛋白激酶(DNA-dependentproteinkinase，DNA-PK)是磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶(PI3K)家族成员之一，主要定位于细胞核，通过非同源未端连接(non-homologousendjoining，NHEJ)的方式进行DNA双链断裂的修复，在维持基因组稳定以及产生抗体多样性的V(D)J重组中发挥着重要作用，其活性受DNA双链断裂的调控。尽管如此，越来越多的研究发现DNA-PKcs在人类细胞中还发挥着诸多其他的重要生物学功能，如维持染色体端粒稳定、调节能量代谢、参与炎症反应、促进有丝分裂以及在细胞周期调控中发挥重要作用等，并且其中很多功能并不直接依赖于DNA双链的断裂。已有研究表明，在多种肿瘤组织中高表达的DNA-PKcs通过自磷酸化的方式激活，进而通过直接或者间接的方式激活mTOR通路，导致肿瘤抗药性的发生。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(MammalianTargetofRapamycin,mTOR)是一种高度保守的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，广泛存在于哺乳动物细胞中，属于磷酸肌醇3-激酶相关激酶(Phosphatidylinositol3-kinase-relatedKinase,PIKK)蛋白家族。哺乳动物细胞中，mTOR以mTORC1和mTORC2两种复合体的形式存在，调控细胞生长、增殖、分化、自噬和凋亡等，在细胞生长中处于核心调控地位。随着对mTOR及其信号通路研究的不断深入，其在诸多疾病中的作用越来越受重视，近年来的研究表明，mTOR的过度激活与组织纤维化的发生发展密切相关，已有研究表明mTOR的过度激活直接激活间质成纤维细胞以及肾小管上皮细胞EMT等，导致细胞外基质大量合成分泌，显著促进了FSGS、膜性肾病及阻塞性肾脏疾病中的肾脏纤维化进程，而抑制mTOR的过度激活能够显著抑制纤维化。尽管如此，由于mTOR本身的重要性，目前还没有直接的特异性抑制mTOR活性的抑制剂用于肾脏纤维化的临床防治。肾小管间质纤维化目前仍然缺乏行之有效的治疗手段。
技术实现思路
针对现有技术中存在的技术问题，本专利技术提供了一种DNA依赖性蛋白激酶活性抑制剂在制备防治肾纤维化相关病症中的用途，所述的这种DNA依赖性蛋白激酶活性抑制剂在制备防治肾纤维化相关病症中的用途解决了现有技术中没有合适的药物用于治疗肾纤维化相关病症中肾脏结构和功能损害的技术问题。本专利技术提供了一种DNA依赖性蛋白激酶(DNA-dependentproteinkinase，DNA-PK)特异性抑制剂在制备防治肾纤维化的药物中的用途。优选上述肾纤维化为单侧输尿管梗阻诱导的肾小管间质纤维化。进一步的，所述的DNA依赖性蛋白激酶活性特异性抑制剂为NU7441。我们在单侧输尿管梗阻(UUO)诱导的肾小管间质纤维化的小鼠模型上使用NU7441，来探讨通过抑制DNA依赖性蛋白激酶活性对肾纤维化改善作用及其机制。结果发现，对UUO诱导的肾小管间质纤维化的小鼠模型使用DNA依赖性蛋白激酶抑制剂NU7441进行干预治疗，可显著减轻UUO小鼠肾脏病理损害，抑制肾组织细胞外基质的沉积，改善肾间质纤维化。NU7441通过特异性抑制DNA-PK激活，进而抑制了mTOR的异常激活，抑制了肾小管上皮细胞上皮-间质细胞转换(EMT)，显著抑制肾小管上皮细胞和间质成纤维细胞在TGF-β1刺激下胶原蛋白的产生，改善肾脏病理损伤和肾功能，起到改善肾小管间质纤维化作用。附图说明图1CCK-8检测DNA-PK特异性抑制剂NU7441的细胞毒性分析图。结果显示小于1μM的NU7441对细胞没有直接的毒副作用。图2Westernblot检测NU7441处理大鼠成纤维细胞后纤维化和增殖相关蛋白表达水平分析图。结果显示NU7441处理能够显著抑制TGFβ1诱导的大鼠成纤维细胞活化。图3免疫荧光和Westernblot检测DNA-PK激活和纤维化相关蛋白表达水平分析图。结果显示NU7441处理能够显著抑制TGFβ1诱导人源肾小管上皮细胞(HK2)纤维化相关蛋白的表达。图4组织病理、Westernblot和荧光定量PCR检测NU7441对小鼠UUO模型肾脏纤维化的影响分析图。结果显示NU7441处理能够显著改善UUO小鼠肾小管间质纤维化。图5Westernblot检测NU7441处理对mTOR通路激活以及细胞EMT的影响分析图。结果显示NU7441处理能够显著抑制mTOR的异常激活和肾小管细胞的EMT。具体实施方式以下通过具体实施例对本专利技术进行进一步说明：实施例1材料和方法1)材料和试剂抑制剂NU7441购于Selleck公司,mTOR、p-mTOR、a-SMA以及PCNA抗体均购于CellSignalingTechnology公司。FN、DNA-PK以及p-DNA-PK抗体购于ABCAM公司。β-actin购于南京巴傲得公司。荧光二抗购于Invitrogen公司。TGFβ1购于R&D公司。WesternBlot所需二抗以及其他试剂均购于Sigma公司。2)细胞培养和处理人源肾小管上皮细胞(HK2)以及大鼠成纤维细胞(NRK49F)用含10％胎牛血清，0.5％青霉素和链霉素的DMEM/F12培养基培养，培养条件为37℃，5％二氧化碳和95％空气。为研究NU7441对于TGFβ1引起的肾脏纤维化保护作用及机制，我们将培养基换成无血清的培养基加入合适浓度的NU7441，同时加入终浓度为5ng/ml的TGFβ1模拟肾脏纤维化，最后收集细胞进行We本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.DNA依赖性蛋白激酶特异性抑制剂在制备防治肾纤维化的药物中的用途。

【技术特征摘要】
1.DNA依赖性蛋白激酶特异性抑制剂在制备防治肾纤维化的药物中的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的肾纤维化为单侧输尿管梗阻诱导的肾小管间质纤维化。3.DNA依赖性蛋白激酶特异性抑制剂在制备抑制mTOR的异常激活...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨运文，游然，于婧，张爱华，贾占军，刘素雯，高慧萍，王佩培，
申请(专利权)人：南京市儿童医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32