制备核酸文库的方法和用于实施所述方法的组合物和试剂盒技术

提供了制备核酸文库的方法。所述方法的方面包括由通过涉及RNA样品的模板转换反应产生的双股互补DNA(cDNA)产生一个或多个文库，包括例如表达文库和/或免疫细胞受体谱系文库。在一些方面，所述方法包括由单细胞制备文库和/或制备在单细胞水平下索引的文库。还提供了用于进行所述方法的组合物和试剂盒。

Methods for preparing nucleic acid libraries and compositions and kits for implementing the methods

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备核酸文库的方法和用于实施所述方法的组合物和试剂盒相关申请的交叉引用按照35U.S.C.§119(e)，本申请要求2017年2月16日提交的美国临时专利申请序列号62/459,858的提交日期的优先权；所述申请的公开内容以引用的方式并入本文中。
技术介绍
下一代测序(NGS)技术的发展已经允许从产生的核酸文库快速提取有价值的基因组和转录物组信息。例如Illumina(Solexa)测序、Roche454测序、Iontorrent(质子/PGM测序)和SOLiD测序等高通量NGS技术允许比先前使用的桑格测序(Sangersequencing)更迅速和廉价地对核酸分子测序，因而这些技术已经彻底改革生物技术和生物医学研究。这些有效的测序技术尤其着重于文库制备。可以使用NGS技术分析充分制备的逆转录互补DNA(cDNA)文库，以达成一系列不同目的。举例来说，取决于文库制备方法，转录物组数据可以用于进行差异表达分析以鉴定在某些情况下上调或下调的基因。cDNA文库还可以用于通过NGS进行T细胞受体(TCR)概况分析。TCR控制T细胞的选择、功能和活化，并确定T细胞对抗原肽-主要组织相容性复合物(MHC)中的哪些复合物反应。由于TCRα-链和β-链基因是从各细胞中可变区、多样性和连接(V(D)J)TCR基因区段的体细胞重组衍生的，所以个体的TCR谱系是非常不同的。对TCR的此多样性进行概况分析推动了对免疫谱系动力学的了解，促进对免疫反应的性质和免疫病症的病变的认识。这样的见解使多种疗法得到发展，包括迅速促进免疫肿瘤学领域。
技术实现思路
提供了制备核酸文库的方法。所述方法的方面包括由通过涉及RNA样品的模板转换反应产生的双股互补DNA(cDNA)产生一个或多个文库，包括例如表达文库和/或免疫细胞受体谱系文库。在一些方面，所述方法包括由单细胞制备文库和/或制备在单细胞水平下索引的文库。还提供了用于进行所述方法的组合物和试剂盒。附图说明图1提供了根据本公开的一实施方案由单一RNA样品制备两个核酸文库的方法的示意图。图2提供了根据本公开的一实施方案由单一RNA样品制备表达文库和免疫细胞受体谱系文库的方法的示意图。图3提供了使用模板转换反应产生产物双股核酸的示意图。图4提供了在文库制备方法中使用标签化的一实例，其可能适用于本公开的方法中。图5提供了展示根据本公开的一实施方案，用于产生用于组合的差异基因表达分析和TCR概况分析的文库的全过程的总示意图。图6提供了显示如本文中提供的有关实例中所述，用于由单T细胞制备TCR概况分析文库的全过程的总示意图。图7描绘了如与图6中所示的实例相关，96孔盘中索引寡核苷酸分布和样品的汇集。图8提供了测试免疫细胞概况分析工作流程的性能的数据，其展示与由单Jurkat细胞或与单细胞同等量的JurkatRNA产生的TCR-α或TCR-βCDR3区域对应的测序读数的百分比。图9提供了测试免疫细胞概况分析工作流程的性能的进一步数据，其展示与预期Jurkat克隆型对应的测序读数的百分比。图10提供了以多样品纳米分配器(MSND)格式测试的单细胞TCR概况分析工作流程的总示意图。图11提供了与TCR-α或TCR-β的CDR3区域对应的来自单Jurkat细胞的测序数据的比对分析的结果。图12A-12D提供了根据本专利技术的一实施方案以多样品纳米分配器(MSND)格式测试的单细胞TCR概况分析工作流程的总细节。图13描绘了如以下实验部分中所述，来自使用图12A至12D的方案产生的免疫细胞受体测序文库的α和β受体读数计数。图14A-14B描绘了如以下实验部分中所述，来自使用图12A-12D的方案产生的分割WTA文库的例示性数据。图14A展示基因身体覆盖率数据，其中X轴上为所有基因上标准化覆盖率且其Y轴上为所有对应的外显子读数。图描绘一种实例CCRF-CEM细胞。图14B展示利用如图13中所述，来自TALL、CCRF和处理(PMA)CCRF细胞的5'DE文库的对应读数的主成分分析。定义如本文所用，术语“杂交条件”意指引物或其它多核苷酸与如下靶核酸区域特异性杂交的条件，所述引物或其它多核苷酸与所述靶核酸区域共享一些互补性。引物是否与靶核酸特异性杂交由如聚合物与靶核酸之间的互补程度和发生杂交的温度等因素决定，发生杂交的温度可以由引物的熔融温度(TM)而得知。熔融温度是指使引物-靶核酸双链体的一半保持杂交且双链体的一半解离成单股的温度。双链体的Tm可以通过实验确定或使用下式预测：Tm＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(分数G+C)–(60/N)，其中N为链长且[Na+]小于1M。参见Sambrook和Russell(2001；MolecularCloning：ALaboratoryManual,第3版,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarborN.Y.,第10章)。取决于多种参数的其它更先进模型也可以用于预测引物/靶双链体的Tm，取决于各种杂交条件。用于实现特异性核酸杂交的方法可以见于例如Tijssen,LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes,第I部分,第2章,“Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays,”Elsevier(1993)中。如本文所用，术语“互补”和“互补性”是指通过非共价键，与整个靶核酸或其区域(例如产物核酸区域)进行碱基配对的核苷酸序列。在典型的沃森-克立克碱基配对(Watson-Crickbasepairing)中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)形成碱基对，如同DNA中鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)一样。在RNA中，胸腺嘧啶由尿嘧啶(U)替代。因而，A与T互补且G与C互补。在RNA中，A与U互补，反之亦然。典型地，“互补”是指至少部分互补的核苷酸序列。术语“互补”还可以涵盖完全互补，使得一股中的每个核苷酸与另一股中对应位置的每个核苷酸互补的双链体。在某些情况下，核苷酸序列可以与靶部分互补，其中不是所有的核苷酸在所有对应的位置都与靶核酸中的每个核苷酸互补。举例来说，引物可以与靶核酸完全(即100％)互补，或引物和靶核酸可以共享一定程度互补性，其小于完全(例如70％、75％、85％、90％、95％、99％)。两个核苷酸序列的同一性百分比可以通过出于最佳比较的目的(例如可以在第一序列的序列中引入缺口以进行最佳比对)比对序列来确定。然后比较对应位置的核苷酸，且两个序列之间的同一性百分比是所述序列共享的同一位置的数目的函数(即同一性％＝同一位置的数目/总位置的数目×100)。当一个序列中的位置被与另一序列中对应位置相同的核苷酸占据时，所述分子在该位置处同一。此类数学算法的一非限制性实例描述于Karlin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877(1993)中。此类算法合并至如Altschul等人,NucleicAcidsRes.25:389-3402(1997)中所述的NBLAST和XB本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种由核糖核酸(RNA)样品制备表达文库和免疫细胞受体谱系文库的方法，所述方法包括：(a)使用模板转换逆转录反应，由RNA样品产生产物双股cDNA；(b)将所产生的产物双股cDNA分割为第一反应混合物和第二反应混合物；以及(c)末端捕捉所述产物双股cDNA以由所述第一反应混合物产生表达文库，并扩增所述产物双股cDNA的免疫细胞特异性cDNA以由所述第二反应混合物产生免疫细胞受体谱系文库。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.02.16 US 62/459,8581.一种由核糖核酸(RNA)样品制备表达文库和免疫细胞受体谱系文库的方法，所述方法包括：(a)使用模板转换逆转录反应，由RNA样品产生产物双股cDNA；(b)将所产生的产物双股cDNA分割为第一反应混合物和第二反应混合物；以及(c)末端捕捉所述产物双股cDNA以由所述第一反应混合物产生表达文库，并扩增所述产物双股cDNA的免疫细胞特异性cDNA以由所述第二反应混合物产生免疫细胞受体谱系文库。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述RNA样品从细胞样品获得。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述RNA样品从单细胞获得。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述单细胞是T细胞或B细胞。5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述分割前汇集由多个单细胞RNA样品产生的产物双股cDNA。6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中用于产生所述产物双股cDNA的引物或寡核苷酸包含鉴定产生所述产物双股cDNA的所述单细胞的索引序列。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述引物或寡核苷酸是模板转换寡核苷酸。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括对所述表达文库和所述免疫细胞受体谱系文库测序。9.根据前述权利要求中任一项...

【专利技术属性】
技术研发人员：马格诺利娅·博斯蒂克，伊施明德尔·曼恩，安德鲁·艾伦·法默，萨拉·泰勒，
申请(专利权)人：宝生物工程美国有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US