一种动态代谢流量分析技术的建立与应用制造技术

本发明专利技术提供了一种动态代谢流量分析技术的建立与应用，具体地，本发明专利技术提供了一种动态流量代谢分析方法，所述方法包括步骤：a)样品制作；b)生物样品的检测：通过色谱质谱联用方法对所述的细胞提取物进行分析，得到一个或多个代谢物的标记比例；c)通过所述的一个或多个代谢物标记比例，计算得到目标代谢物的胞内代谢流量。本发明专利技术方法具有成本低，分析快速等优点。

Establishment and Application of a Dynamic Metabolic Flow Analysis Technology

【技术实现步骤摘要】
一种动态代谢流量分析技术的建立与应用
本专利技术涉及分子生物学领域，具体地，本专利技术提供了一种动态代谢流量分析技术，及其在细胞代谢中的应用。
技术介绍
细胞代谢是维持生命所需物质和能量的基础，具体由胞内代谢酶催化完成。代谢流量即是指胞内代谢反应的速率，它并不能直接测量，而是通过结合数学模型和代谢产物的同位素标记信息算得的数值；测定代谢流量速率的方法称为代谢流量分析。代谢流量大小是由基因-蛋白-代谢物间的相互作用综合决定的，它能够帮助解析细胞生命活动的机制；此外代谢流量的解析可以寻找潜在的靶点为代谢工程的理性改造提供依据。此处代谢流量分析与流平衡分析相区分。传统的代谢流量分析是利用细胞摄取13C标记的底物并且在胞内经过代谢反应对碳骨架断裂重排产生的丰富的标记信息作为约束条件结合数学模型算出胞内流量的一种方法。由于胞内代谢物转化速率快和浓度低的特点，对样品的制备、代谢物的分离和检测仪器的灵敏度都有很高的要求。以13C标记的底物作为碳源，在代谢稳态的条件下经过足够长的时间，胞内代谢物和蛋白质等生物质会达到标记稳态。在大肠杆菌中胞内中间代谢物约占细胞干重的3％，蛋白约占细胞干重的50％。由于氨基酸的前体直接来源于中心碳代谢并且细胞蛋白中的氨基酸含量丰富性质稳定，可以通过检测蛋白中氨基酸标记信息来计算中心碳代谢的流量，这种方法因为操作简单可重复性高的特点而被广泛使用。传统的代谢流量分析的主要优点在于细胞蛋白含量丰富并且氨基酸的性质稳定使得标记信息易于获取。缺点在于需要在13C标记培养基中培养很长的时间才能达到胞内蛋白的标记稳态，而13C标记底物比较昂贵；在长时间的培养过程中需要保证细胞处于代谢稳态的条件；只能解析中心碳代谢和氨基酸代谢途径的流量。在代谢拟稳态的研究基础上，科学家们创造各种条件试图实现动态代谢流量分析。1999年，德国科学家U.Schaefer等人在AnalyticalBiochemistry杂志上发表了一篇题为AutomatedSamplingDeviceforMonitoringIntracellularMetaboliteDynamics的文章，介绍了一种培养罐结合履带传送装备的仪器可以实现自动化快速取样，通过将菌体在-50℃的60％甲醇里代谢淬灭，再利用高氯酸对离心收集的细胞进行代谢物提取，取样频率可以达到4.5秒每次。这是早期人们对实时测量胞内代谢物的一种尝试，但是这样一套方法设备成本高，而且代谢淬灭时有细胞破裂的风险等缺点。因此，本领域尚缺乏一类低成本，快速进行动态代谢流量分析的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种低成本，快速进行动态代谢流量分析的方法。本专利技术的第一方面，提供了一种动态流量代谢分析方法，包括步骤：a)样品制作：(a-1)将在滤纸上进行培养的细胞转移至含有同位素标记物的环境进行继续培养；(a-2)在取样时间点，将所述滤纸上的细胞翻扣至提取液中，形成提取液-细胞混合物；(a-3)用所述的提取液-细胞混合物制备得到细胞提取物；b)生物样品的检测：通过色谱质谱联用方法对所述的细胞提取物进行分析，得到一个或多个代谢物的标记比例；c)通过所述的一个或多个代谢物标记比例和胞内浓度，利用微分方程模型计算得到目标代谢物的胞内代谢流量。在另一优选例中，所述的转移前，将所述的细胞在滤纸上培养至氮限状态。在另一优选例中，所述的同位素标记物为Na15NO3。在另一优选例中，本方法依托滤纸培养可以实现细胞生长环境的快速切换、细胞代谢物的快速淬灭和提取；可以用于研究细胞应对外部环境如营养物质、药物处理等变化条件下，细胞在代谢层次上的调控机制。在另一优选例中，本方法以蓝细菌集胞藻6803在氮限切换到氮丰富条件下，解析胞内精氨酸合成途径代谢流量为例，但不限于该例。在另一优选例中，本方法的特点在于依托滤纸培养可以实现细胞生长环境的快速切换、细胞代谢物的快速淬灭和提取。任何借助滤纸培养实现动态代谢流量分析目的的方法均应在权利要求内。在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：计算生物体反应过程中代谢物的标记比例，通过代谢反应途径微分方程式计算目标代谢物的流量。在另一优选例中，所述的目标代谢物为瓜氨酸。在另一优选例中，所述的代谢物包括：瓜氨酸同位体、Gln58片段同位体、鸟氨酸同位体。在另一优选例中，所述的瓜氨酸同位体的分布随时间的变化通过以下微分方程式描述：其中vOTC是通过鸟氨酸转氨甲酰酶的流量，CCIT是瓜氨酸的胞内浓度。在另一优选例中，在所述计算前还包括步骤：对于代谢物的标记比例进行天然同位素丰度矫正。在另一优选例中，所述的天然同位素丰度矫正包括：C13丰度矫正。在另一优选例中，所述的丰度矫正包括：在用气相质谱联用检测时应对衍生剂中的硅进行天然同位素丰度矫正。在另一优选例中，所述的C13丰度矫正通过以下公式进行：在另一优选例中，所述的步骤(a-1)包括：将在在含有Na14NO3的环境下培养完毕的菌液抽滤在滤纸上，培养至氮限状态。在另一优选例中，在转移至过滤介质前，所述的细胞在BG11液体培养基中培养。在另一优选例中，在转移至过滤介质前，所述的细胞在BG11固体培养基琼脂中培养。在另一优选例中，所述的步骤(a-2)包括：将带有菌落的所述过滤介质翻扣于提取液中，完成代谢终止，从而形成提取液-细胞混合液。在另一优选例中，所述的提取液为含甲酸的乙腈：甲醇：水＝2:1:1(v:v:v)混合溶液。在另一优选例中，所述的细胞选自下组：蓝细菌集胞藻，优选为蓝细菌集胞藻6803。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1：N15标记鸟氨酸转氨甲酰酶的底物和产物；a,鸟氨酸转氨甲酰酶催化的反应；b,谷氨酰胺中酰胺氮的动态标记数据；c,鸟氨酸的动态标记数据；d,瓜氨酸的动态标记数据。具体实施方式本专利技术人经过长期而深入的研究，提供了一种全新的动态流量代谢分析技术。所述的技术采用滤纸培养结合稳定同位素标记物(如13C、15N、2H等)，可以对生物体内包括物质代谢和能量代谢途径在内的绝大多数代谢途径在多种细胞扰动的条件下进行细胞动态代谢流量分析。该方法成本低，且中间代谢物平衡时间短，相较于本领域已有的传统C13代谢流量分析技术具有更好的适用性。动态代谢流量分析技术在代谢稳态的条件下实时检测胞内代谢物标记状态从无到有的变化过程结合胞内代谢物的浓度数据可以计算胞内的代谢流量，这种方法称为动态代谢流量分析。动态代谢流量分析相对于传统的代谢流量分析有以下优点：非稳态同位素标记实验所需的时间大大减少，这是由于非稳态同位素标记实验直接检测胞内代谢物而不是蛋白质来源的氨基酸；对于光合生物、甲基营养菌等利用一碳化合物的生物传统的代谢流量分析无法应用，而动态代谢流量分析可以检测到代谢物标记度随时间的变化进而算的胞内代谢流量；可以分析中心碳代谢和氨基酸途径以外的其它途径。但是动态代谢流量分析在样品的制作、生物样品的检测平台、数学模型的处理这3个方面有更高的要求。a)样品的制作：动态代谢流量分析要求实时检测胞内中间代谢物的标记状态，由于胞内中间代谢物转化速率快，所以需要快速有效的终止代谢反应并提取中间代谢物：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种动态流量代谢分析方法，其特征在于，包括步骤：a)样品制作：(a‑1)将在滤纸上进行培养的细胞转移至含有同位素标记物的环境进行继续培养；(a‑2)在取样时间点，将所述滤纸上的细胞翻扣至提取液中，形成提取液‑细胞混合物；(a‑3)用所述的提取液‑细胞混合物制备得到细胞提取物；b)生物样品的检测：通过色谱质谱联用方法对所述的细胞提取物进行分析，得到一个或多个代谢物的标记比例；c)通过所述的一个或多个代谢物标记比例和胞内浓度，利用微分方程模型计算得到目标代谢物的胞内代谢流量。

【技术特征摘要】
1.一种动态流量代谢分析方法，其特征在于，包括步骤：a)样品制作：(a-1)将在滤纸上进行培养的细胞转移至含有同位素标记物的环境进行继续培养；(a-2)在取样时间点，将所述滤纸上的细胞翻扣至提取液中，形成提取液-细胞混合物；(a-3)用所述的提取液-细胞混合物制备得到细胞提取物；b)生物样品的检测：通过色谱质谱联用方法对所述的细胞提取物进行分析，得到一个或多个代谢物的标记比例；c)通过所述的一个或多个代谢物标记比例和胞内浓度，利用微分方程模型计算得到目标代谢物的胞内代谢流量。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括步骤：计算生物体反应过程中代谢物的标记比例，通过代谢反应途径微分方程式计算目标代谢物的流量。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的目标代谢物为瓜氨酸。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的代谢物包括：瓜氨酸同位体、G...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨琛，刘丽霞，张昊，刘玉洁，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海,31