用改变ppc基因的细菌发酵生产L-赖氨酸的方法技术

本发明专利技术提供了发酵生产L‑赖氨酸的方法，其包括改造谷氨酸棒杆菌染色体上野生型的ppc基因；和，用改造而得到的谷氨酸棒杆菌发酵生产L‑赖氨酸。另外，本发明专利技术还提供了由该方法衍生的方法和应用，以及可以用在这些方法和应用中的谷氨酸棒杆菌、多核苷酸等。

Production of L-Lysine by Bacterial Fermentation with Changed PPC Gene

【技术实现步骤摘要】
用改变ppc基因的细菌发酵生产L-赖氨酸的方法
本专利技术属于氨基酸发酵领域，具体而言，本专利技术涉及发酵生产L-赖氨酸的方法及其衍生的方法和应用，和可以用在这些方法和应用中的细菌等。
技术介绍
通过产L-赖氨酸的细菌（如，埃希氏菌属的大肠杆菌和棒杆菌属的杆状细菌）发酵来生产L-赖氨酸已经得到了产业化应用。这些细菌，可以是从自然界分离的细菌，也可以是通过诱变或基因工程改造获得的细菌，或者两者兼而有之。现有文献中有报道ppc（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，phosphoenolpyruvatecarboxylase）基因及其编码蛋白的增加、减少或突变等用于氨基酸（包括L-赖氨酸）生产中，例如，WO0100844A2、WO2005058945A2、EP0358940A1和JP1998165180A等，然而，突变后的蛋白质活性是难以预料的，相应地，其对L-赖氨酸生产的影响也难以预料，尤其是，近十多年来，对ppc基因及其编码蛋白的突变对L-赖氨酸生产的影响的新的研究已经越来越少，表明研究人员对是否有新的ppc基因及其编码蛋白的突变来改善L-赖氨酸生产的兴趣已经越来越小了。本专利技术人没有受到近十多年来的趋势影响，经过长期研究和实践，尤其凭借了一些运气，偶然发现对ppc基因的新的改造能够有助于提高谷氨酸棒杆菌发酵生产L-赖氨酸的产量。而且，该方法与现有改造的大量高产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的染色体改造位点没有冲突，可以叠加提高的效果，从而在实践上可用于谷氨酸棒杆菌发酵生产L-赖氨酸。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供新的发酵生产L-赖氨酸的方法及其相关的方法，包括相对于未改造谷氨酸棒杆菌提高L-赖氨酸的发酵生产量的方法，改造的谷氨酸棒杆菌在发酵生产L-赖氨酸中的应用，改造的谷氨酸棒杆菌在相对于未改造谷氨酸棒杆菌提高L-赖氨酸的发酵生产量的应用，和/或，改造谷氨酸棒杆菌的方法等。另外，本专利技术还提供了可以用于上述方法中的突变蛋白、多核苷酸、载体和/或谷氨酸棒杆菌等。具体而言，在第一方面，本专利技术提供了发酵生产L-赖氨酸的方法，其包括：（1）改造谷氨酸棒杆菌染色体上野生型的ppc基因，使其编码的蛋白质的第482位发生突变；和，（2）用步骤（1）改造而得到的谷氨酸棒杆菌发酵生产L-赖氨酸。在本文中，术语“改造”指的是是相应被改造的对象发生变化，从而达到一定的效果。改造位于染色体上的基因或调控元件的手段包括但是不限于，诱变、定点突变、和/或同源重组，优选是后两者。改造位于染色体上的基因或调控元件使得该基因或调控元件的核苷酸序列被添加、缺失或替换一个或多个核苷酸。这些技术手段广泛记载于分子生物学和微生物学文献中，有许多甚至已经商品化了。在本专利技术的具体实施方式中，根据同源重组的原理，可以采用Addgene公司商品化的pKOV质粒系统来进行改造，也可以采用pK18mobsacB质粒系统来进行改造，改造谷氨酸棒杆菌染色体上的野生型的ppc基因和/或其调控元件。因此，在本文中，优选改造是通过同源重组进行的改造。本专利技术人经过长期研究发现，在谷氨酸棒杆菌中，使野生型的ppc基因编码的蛋白质的第482位发生突变，尤其是在对ppc基因启动子改造的情况下，可以提高L-赖氨酸的。在本专利技术的具体实施方式中，野生型的ppc基因编码的蛋白质的第482位发生A482V突变，即丙氨酸残基（Ala）被取代为缬氨酸残基（Val）。野生型的ppc基因所编码的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示，在本专利技术的具体实施方式中，野生型的ppc基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1的互补序列所示。另外，发生突变的ppc基因所编码的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示，在本专利技术的具体实施方式中，发生突变的ppc基因的核苷酸序列如SEQIDNO：2的互补序列所示。在本专利技术的具体实施方式中，用如SEQIDNO：2的互补序列所示的核苷酸序列取代谷氨酸棒杆菌染色体上的如SEQIDNO：1的互补序列所示的核苷酸序列，实施改造。相应地，本专利技术还提供了其他的应用或方法。例如，在第二方面，本专利技术提供了提高L-赖氨酸的发酵量的方法，其包括：（1）改造谷氨酸棒杆菌染色体上野生型的ppc基因，使其编码的蛋白质的第482位发生突变；和，（2）用步骤（1）改造而得到的谷氨酸棒杆菌发酵生产L-赖氨酸。L-赖氨酸作为细菌的重要代谢产物，大多数细菌或多或少都能够发酵产生一定量的L-赖氨酸，尤其是谷氨酸棒杆菌。尽管低产L-赖氨酸的细菌不适合有经济效益地生产L-赖氨酸，但是通过本专利技术的方法，仍旧能提高L-赖氨酸的发酵量，仍旧可以供对经济效益不敏感的地方使用。当然，在本文中，优选细菌是高产L-赖氨酸的细菌。通过本专利技术的方法，可以进一步提高其产量。另外，在本专利技术的方法或应用中，除了改造细菌染色体上ppc基因和/或其调控元件以外，可以不再进行其他改造，当然也可以进行其他改造。又如，在第三方面，本专利技术提供了改造获得的谷氨酸棒杆菌在发酵生产L-赖氨酸中的应用，其中，所述改造获得是改造谷氨酸棒杆菌染色体上野生型的ppc基因，使其编码的蛋白质的第482位发生突变，而获得。改造获得的谷氨酸棒杆菌可以单独应用于发酵生产L-赖氨酸中，也可以和其他产L-赖氨酸的细菌混合发酵生产L-赖氨酸，或者以其他方式应用于发酵生产L-赖氨酸中。在本文中，如无特别限定（如未以“改造获得”来限定），术语“谷氨酸棒杆菌”是未改造或改造前的谷氨酸棒杆菌，其染色体的ppc基因及该基因座位前后的调控元件是是野生型的。还如，在第四方面，本专利技术提供了改造获得的谷氨酸棒杆菌在提高L-赖氨酸的发酵量中的应用，其中，所述改造获得是改造谷氨酸棒杆菌染色体上野生型的ppc基因，使其编码的蛋白质的第482位发生突变，而获得。在本文中，谷氨酸棒杆菌可以是产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌。诸如北京棒杆菌，其特性，尤其是野生型的ppc基因及其前后的调控元件，与谷氨酸棒杆菌基本相同，因此也可以纳入本专利技术的谷氨酸棒杆菌的范围内。更本质地，在第五方面，本专利技术提供了改造谷氨酸棒杆菌的方法，其包括改造谷氨酸棒杆菌染色体上野生型的ppc基因，使其编码的蛋白质的第482位发生突变。本专利技术第五方面的方法改造而获得的谷氨酸棒杆菌能够用于发酵生产或产生L-赖氨酸。因此，在第六方面，本专利技术提供了本专利技术第五方面的方法改造而获得的谷氨酸棒杆菌。优选在本专利技术中，步骤（1）进一步包括：改造谷氨酸棒杆菌染色体上野生型的ppc基因的启动子区域，使该启动子区域缺失一个或几个核苷酸。更优选，改造谷氨酸棒杆菌染色体上野生型的ppc基因的启动子区域，在ppc基因的第-1位缺失一个核苷酸。基因的-1位是基因编码区第一个密码子之前紧邻的一个核苷酸，这是本领域技术人员所熟知的。在本专利技术的具体实施方式中，野生型的ppc基因的启动子区域的核苷酸序列如SEQIDNO：5的第2761-3360位的互补序列所示，野生型的ppc基因的启动子区域缺失一个核苷酸后的核苷酸序列如SEQIDNO：6的第2761-3359位的互补序列所示，用后者的核苷酸序列取代前者的核苷酸序列，实施进一步的改造。改造谷氨酸棒杆菌染色体上野生型的ppc基因在改造谷氨酸棒杆菌染色体上野生型的ppc基因的启动子区域的同时、之前或之后。在本专利技术的具体实施方式中，改造谷氨酸棒杆本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.发酵生产L‑赖氨酸的方法或者提高L‑赖氨酸的发酵量的方法，其包括：（1）改造谷氨酸棒杆菌染色体上野生型的ppc基因，使其编码的蛋白质的第482位发生突变，优选发生A482V突变；和，（2）用步骤（1）改造而得到的谷氨酸棒杆菌发酵生产L‑赖氨酸。

【技术特征摘要】
1.发酵生产L-赖氨酸的方法或者提高L-赖氨酸的发酵量的方法，其包括：（1）改造谷氨酸棒杆菌染色体上野生型的ppc基因，使其编码的蛋白质的第482位发生突变，优选发生A482V突变；和，（2）用步骤（1）改造而得到的谷氨酸棒杆菌发酵生产L-赖氨酸。2.改造获得的谷氨酸棒杆菌在发酵生产L-赖氨酸或者提高L-赖氨酸的发酵量中的应用，其中，所述改造获得是改造谷氨酸棒杆菌染色体上野生型的ppc基因，使其编码的蛋白质的第482位发生突变，优选发生A482V突变，而获得。3.改造谷氨酸棒杆菌的方法，其包括改造谷氨酸棒杆菌染色体上野生型的ppc基因，使其编码的蛋白质的第482位发生突变，优选发生A482V突变。4.权利要求1-3之任一所述的方法或应用，其中，野生型的ppc基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1的互补序列所示；和/或，野生型的ppc基因所编码...

【专利技术属性】
技术研发人员：周晓群，孟刚，魏爱英，苏厚波，马风勇，赵春光，
申请(专利权)人：黑龙江伊品生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23