用于预测乙肝患者肝癌易感性的引物、探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于预测乙肝患者肝癌易感性的引物、探针及试剂盒，属于体外核酸检测领域，用于预测乙肝患者肝癌易感性的试剂盒包括检测G1896A、A1762T和G1764A三个突变位点的引物和探针。本发明专利技术提供的引物、探针，检测结果与测序结果准确率高达100％；可同时检测位点的野生型、突变型，结果准确可靠；本发明专利技术检测的HBV基因组DNA浓度检测下限为100IU/mL，能够满足市场上低病毒浓度的基因检测需求；本发明专利技术提供的试剂盒不受样本例数的限制，可分配检测样本例数、样本例数少时无需攒样、出具实验结果快速便捷。

Primers, probes and kits for predicting susceptibility to hepatocellular carcinoma in patients with hepatitis B

【技术实现步骤摘要】
用于预测乙肝患者肝癌易感性的引物、探针及试剂盒
本专利技术属于体外核酸检测领域，具体涉及一种用于预测乙肝患者肝癌易感性的引物、探针及试剂盒。
技术介绍
乙型肝炎病毒HBV感染是导致肝癌发生的重要因素之一，乙型肝炎病毒(HBV)感染导致的肝癌占60％以上。乙肝患者慢性感染5年后，有10-20％的患者将发展为肝硬化，6-15％的慢性肝硬化患者和乙肝患者会发展为肝癌。肝癌是严重危害中国人生命健康的最主要癌症之一，是亟需解决的重大公共卫生问题。临床上乙型肝炎E抗原(HBeAg)转印以及乙型肝炎E抗体(HBeAb)阳性常被认为是已产生抗病毒抗体，病毒的复制得到抑制，肝损伤和肝癌的发生风险降低，甚至可作为治疗的终止指标。但近年来研究表明HBeAg阴性患者发生肝癌的比例逐年增加，主要原因是虽然HBeAg为阴性但是病毒仍在复制，肝损伤仍在继续。HBV基因组有四个基因区，分别为S，C，P，X区。C基因区包括preC(前C)区和C(core)区。C基因区突变导致HBeAg表达异常，最常见的突变为C区核心启动子(BCP)区的1762T和1764A的双突变，该突变导致前C区mRNA转录减少导致HBeAg合成分泌量降低。有研究表明preC区1896A的突变也会造成HBeAg的合成抑制甚至合成终止。有大量的研究表明肝癌患者中1896A的突变率为52％，1762T和1764A突变率为66％，具有显著的高突变率，HBV基因组的突变和乙肝患者发生肝癌相关。因此，检测HBV基因组突变有助于医生给予乙肝患者更精准的医疗建议。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种通过检测HBV基因组上的G1896A突变、A1762T和G1764A的双突变情况联合预测乙肝患者发生肝癌的风险的引物、探针及试剂盒。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：用于预测乙肝患者肝癌易感性的引物和探针，包括检测G1896A、A1762T和G1764A三个突变位点的引物和探针：检测G1896A的引物和探针的序列如SEQIDNo：1、SEQIDNo：2、SEQIDNo：5和SEQIDNo：6所示；检测A1762T和G1764A的引物和探针的序列如SEQIDNo：3、SEQIDNo：4、SEQIDNo：7、SEQIDNo：8、SEQIDNo：9和SEQIDNo：10所示。本专利技术还提供了一种用于预测乙肝患者肝癌易感性的试剂盒，包括上述的用于预测乙肝患者肝癌易感性的引物和探针。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的引物、探针优点在于：检测结果与测序结果准确率高达100％；可同时检测位点的野生型、突变型；相比使用ΔCt值法的判断结果更易判断，结果可以通过分型软件准确分型，还可以通过荧光定量PCR曲线进行确认复核，结果准确可靠；本专利技术检测的HBV基因组DNA浓度检测下限为100IU/mL，能够满足市场上低病毒浓度的基因检测需求；本专利技术提供的试剂盒不受样本例数的限制，可分配检测样本例数、样本例数少时无需攒样、出具实验结果快速便捷。本专利技术在利用实时荧光PCR探针技术高灵敏度和高特异性的优点基础上，优选特异性好的引物及探针序列组成试剂盒，提高突变位点检测特异性。附图说明图1所示为本专利技术的具体实施方式的FAM通道HBV1896G野生型扩增曲线图；图2所示为本专利技术的具体实施方式的HEX通道HBV1896A突变型扩增曲线图；图3所示为本专利技术的具体实施方式的FAM通道HBV1762A和1764G野生型扩增曲线图；图4所示为本专利技术的具体实施方式的HEX通道HBV1762T和1764A双突变型扩增曲线图；图5所示为本专利技术的具体实施方式的CY5通道HBV1764A单突变型扩增曲线图；图6所示为本专利技术的具体实施方式的ROX通道HBV1762T单突变型扩增曲线图。具体实施方式为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。本专利技术最关键的构思在于：使用实时荧光定量PCR技术，在常规PCR的基础上加入相应的荧光探针来实现易感位点分型的功能，通过检测HBV基因组上的G1896A突变、A1762T和G1764A的双突变情况联合预测乙肝患者发生肝癌的风险。请参照表1(引物)和表2(探针)，本专利技术的用于预测乙肝患者肝癌易感性的引物和探针，包括检测G1896A、A1762T和G1764A三个突变位点的引物和探针：检测G1896A的引物和探针的序列如SEQIDNo：1、SEQIDNo：2、SEQIDNo：5和SEQIDNo：6所示；检测A1762T和G1764A的引物和探针的序列如SEQIDNo：3、SEQIDNo：4、SEQIDNo：7、SEQIDNo：8、SEQIDNo：9和SEQIDNo：10所示。表1名称序列(5’-3’)碱基数SEQIDNo：11896-F1CCTACTGTTCAAGCCTCCAAGC22SEQIDNo：21896-R1GCTCCAAATTCTTTATACGGGTC23SEQIDNo：31762-FGTCAACGACCGACCTTGAGG20SEQIDNo：41762-RGTTGCATGGTGCTGGTGAAC20表2其中，上述探针3’端使用MGB修饰或者不修饰，5’端的修饰可以为FAM、HEX、CY3、CY5，荧光基团不限。用于预测乙肝患者肝癌易感性的试剂盒，包括上述的用于预测乙肝患者肝癌易感性的引物和探针。从上述描述可知，本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的引物、探针优点在于：检测结果与测序结果准确率高达100％；可同时检测位点的野生型、突变型；相比使用ΔCt值法的判断结果更易判断，结果可以通过分型软件准确分型，还可以通过荧光定量PCR曲线进行确认复核，结果准确可靠；本专利技术检测的HBV基因组DNA浓度检测下限为100IU/mL，能够满足市场上低病毒浓度的基因检测需求；本专利技术提供的试剂盒不受样本例数的限制，可分配检测样本例数、样本例数少时无需攒样、出具实验结果快速便捷。本专利技术在利用实时荧光PCR探针技术高灵敏度和高特异性的优点基础上，优选特异性好的引物及探针序列组成试剂盒，提高突变位点检测特异性。进一步的，用于预测乙肝患者肝癌易感性的试剂盒，包括PCR反应液1和PCR反应液2；所述PCR反应液1包括检测G1896A的引物和探针；所述PCR反应液2包括检测A1762T和G1764A的引物和探针。从上述描述可知，通过对引物和探针进行分组，有效改善了不同引物之间的相互干扰，提高了检测的灵敏度。进一步的，每个PCR反应液还包括Taq酶、dNTP、UNG酶和Mg2+。从上述描述可知，引入UNG酶防污染系统，能更加准确、稳定的对样品进行分型检测。进一步的，用于预测乙肝患者肝癌易感性的试剂盒，还包括阳性质控品1、阳性质控品2、阳性质控品3、阳性质控品4和阴性质控品；所述阳性质控品1为已灭活的HBV1896A型的血清样本，浓度为1000IU/mL；所述阳性质控品2为已灭活的HBV1762T、1764A型的血清样本，浓度为1000IU/mL；所述阳性质控品3为已灭活的HBV1762T、1764G型的血清样本，浓度为1000IU/mL；所述阳性质控品4为已灭活的HBV1762A、1764A型的血清样本，浓度为1000IU/mL；所述阴性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于预测乙肝患者肝癌易感性的引物和探针，其特征在于，包括检测G1896A、A1762T和G1764A三个突变位点的引物和探针：检测G1896A的引物和探针的序列如SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：5和SEQ ID No：6所示；检测A1762T和G1764A的引物和探针的序列如SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：7、SEQ ID No：8、SEQ ID No：9和SEQ ID No：10所示。

【技术特征摘要】
1.用于预测乙肝患者肝癌易感性的引物和探针，其特征在于，包括检测G1896A、A1762T和G1764A三个突变位点的引物和探针：检测G1896A的引物和探针的序列如SEQIDNo：1、SEQIDNo：2、SEQIDNo：5和SEQIDNo：6所示；检测A1762T和G1764A的引物和探针的序列如SEQIDNo：3、SEQIDNo：4、SEQIDNo：7、SEQIDNo：8、SEQIDNo：9和SEQIDNo：10所示。2.用于预测乙肝患者肝癌易感性的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的用于预测乙肝患者肝癌易感性的引物和探针。3.根据权利要求2所述的用于预测乙肝患者肝癌易感性的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液1和PCR反应液2；所述PCR反应液1...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛怡婷，
申请(专利权)人：阿吉安福州基因医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35