本发明专利技术公开了一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ‑谷胺酰转肽酶的方法，以该菌株为出发菌株，包括以下步骤：取液体培养基置于三角瓶中，按1‑10％v/v的接种量接入菌体种子，进行摇瓶发酵，发酵条件为20‑40℃，100‑300rpm，发酵培养48h后，将发酵液离心去除菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得γ‑谷胺酰转肽酶，所述液体培养基包括麦芽糖、玉米粉、酵母膏和无机盐，所述无机盐浓度比为1：5‑5：1的MgSO4·7H2O和K2HPO4·3H2O混合物。该发酵工艺方法通过优化培养基种类和浓度，获得了较高活性和抑菌作用的γ‑谷胺酰转肽酶。该制备工艺简单、条件易控制,适合工业化生产。
Preparation of gamma-glutamic transpeptidase with bacteriostasis by fermentation
【技术实现步骤摘要】
通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法
本专利技术涉及一种异源二聚体酶制备方法，特别是涉及一种γ-谷胺酰转肽酶制备方法，应用于生物工程
技术介绍
γ-谷氨酰转肽酶(γ-Glutamyltranspeptidase,GGT)是包含一个大亚基(～40kDa)和一个小亚基(～20kDa)的异源二聚体酶，能够催化γ-谷氨酰类物质(如谷胱甘肽)的γ-谷氨酰键的断裂，并且转移γ-谷氨酰基到其他的氨基酸或肽类物质。在生物体内，GGT主要的生理功能是参与γ-谷氨酰循环，为细胞转运氨基酸类物质。GGT广泛存在于细菌、真菌、植物和哺乳动物中，不同生物中的GGT存在位置不同：在细菌中，GGT位于周质空间或者是分泌到胞外环境中；在哺乳动物细胞内，GGT绑定在血浆膜的外表面；在植物细胞中，GGT存在非原质体和液泡中。γ-谷氨酰转肽酶作为催化β-谷氨酰基部分向受体转移的酶，具有多种生化功能，主要用于合成多种食品及医药功能性γ-谷氨酰基化合物，如L-茶氨酸，具有镇静减压、增强免疫力和预防肿瘤等重要作用，但在生鲜农产品防腐保鲜的报道较少。γ-谷氨酰转肽酶的生产方法有多种，有化学合成法、基因重组法和微生物发酵法，但是，通过化学法合成具有副产物多，合成周期大、产量较少等缺点；而微生物发酵法是目前最常见的方法之一，与其他方法相比，该法具有生产条件可工业化、生长周期相对较短等优点。目前我国通过微生物发酵法制备γ-谷胺酰转肽酶存在生产成本高及提取工艺复杂等缺点，难以实现大规模工业化生产和应用，这成为亟待解决的技术问题。
技术实现思路
为了解决现有技术问题，本专利技术的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，采用优化发酵工艺中的培养基处方，获得高活性具有抑菌作用的γ-谷氨酰转肽酶，本专利技术发酵工艺方法通过优化培养基种类和浓度，获得了较高活性和抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶，制备工艺简单，条件易控制，成本低，适合工业化生产。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，采用枯草芽孢杆菌株进行发酵，制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶。作为本专利技术优选技术方案，一种制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，包括如下步骤：(1)微生物发酵过程：取液体培养基置于三角瓶中，以枯草芽孢杆菌株与液体培养基的体积比为菌体种子的接种量，按1-10％v/v的接种量接入枯草芽孢杆菌株的菌体种子，在三角瓶中得到发酵原液，进行摇瓶发酵，发酵条件为20-40℃，控制摇瓶转速为100-300rpm，进行发酵培养至少48h，得到发酵液；优选上述液体培养基包括麦芽糖、玉米粉、酵母膏和无机盐，优选上述无机盐为质量浓度比为1:5-5:1的MgSO4·7H2O和K2HPO4·3H2O的混合盐；(2)γ-谷胺酰转肽酶的分离和纯化过程：将在所述步骤(1)中制备的发酵液经过离心除去菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得溶菌酶。作为本专利技术优选技术方案，在所述步骤(1)配制的发酵原液中，所述麦芽糖的浓度范围为20-80g/L，所述酵母浸膏浓度范围为10-40g/L，玉米粉浓度范围为1-30g/L。作为本专利技术最佳技术方案，在所述步骤(1)配制的发酵原液中，所述麦芽糖的浓度为60g/L，所述酵母浸膏浓度为32.4g/L，玉米粉浓度范围为10g/L。作为本专利技术优选技术方案，在所述步骤(1)配制的发酵原液中，所述MgSO4·7H2O浓度范围为0.5-5g/L，K2HPO4·3H2O浓度范围为1-5g/L。作为本专利技术最佳技术方案，在所述步骤(1)配制的发酵原液中，所述MgSO4·7H2O浓度为1g/L，K2HPO4·3H2O浓度为2g/L。作为本专利技术优选技术方案，在所述步骤(1)中配制发酵原液时，接种量为6％v/v。作为本专利技术优选技术方案，在所述步骤(1)中进行发酵时，控制发酵条件为28-40℃，发酵原液的初始pH为5.5-7.5。作为本专利技术最佳技术方案，在所述步骤(1)中进行发酵时，控制发酵条件为37℃，控制摇瓶转速为200-300rpm，发酵原液的初始pH为6.0-6.5。作为本专利技术优选技术方案，本专利技术方法所制备的具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的活性达到1600±31U/L,所制备的具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶抑制荔枝胶孢炭疽菌抑菌率达36.36±2.20％。γ-谷氨酰转肽酶的来源不同，酶的化学性质差异很大，其生长条件也有一定差异。在不控制发酵条件下，γ-谷氨酰转肽酶合成与细胞生长部分相关，细胞生长的对数期和稳定期都能进行酶的合成，在稳定期后期酶的合成量达到最大，葡萄糖的存在抑制酶的合成；培养温度对γ-谷氨酰转肽酶合成的影响分析表明，低温延长了细胞的延滞期和对数期，不能够刺激细胞γ-谷氨酰转肽酶合成；高温下会导致γ-谷氨酰转肽酶合成后快速降解，37℃为最适产酶温度。发酵过程pH控制对γ-谷氨酰转肽酶合成具有显著的影响，酸性环境能够刺激酶的合成，碱性环境抑制酶的合成，最适的产酶pH值为6。溶解氧的提高能够促进细胞的生长，但在稳定期，过高的溶氧会导致γ-谷氨酰转肽酶的稳定性降低；低溶氧条件有利于酶的合成却使得细胞生长处于氧限制状态。谷氨酸的添加能够抑制γ-谷氨酰转肽酶的合成，而γ-谷氨酰转肽酶的抑制剂仅使胞外的谷氨酸浓度降低，结合胞外聚谷氨酸的链长随γ-谷氨酰转肽酶活性增加不断减少，推测γ-谷氨酰转肽酶在细胞中的作用为从末端水解聚谷氨酸，为细胞在稳定生长提供谷氨酸。枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)是芽孢杆菌属的一种，是一种嗜温性的好氧革兰氏阳性杆状细菌，可以产生大量丰富蛋白质、氨基酸衍生物等，在医药、食品、农牧等领域有着广泛应用。本专利技术优选采用枯草芽孢杆菌BacillussubtilisCF-3(保藏号CCTCCM2016125)是从豆腐乳中分离鉴定出的一株生防细菌，能够产生γ-谷氨酰转肽酶，该酶具有抑制采后病原微生物的作用，前期未有针对γ-谷氨酰转肽酶发酵工艺优化，提高γ-谷氨酰转肽酶的产量的研究，导致该菌和具有抑菌作用的γ-谷氨酰转肽酶在实际生产中应用受限。本专利技术与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：1.本专利技术枯草芽孢杆菌CF-3产γ-谷胺酰转肽酶抑菌制剂对荔枝胶孢炭疽菌的生长有抑制作用；2.本专利技术可产生γ-谷胺酰转肽酶抑菌制剂涂布于真菌培养皿中，用无菌的打孔器在培养3-5d的炭疽菌平板上取长势一致的一圈打取直径为6mm菌块放入平板中央，放入28℃生化培养箱中培养4天后观察抑菌效果并用十字交叉法测量菌落直径，检测到该制剂对荔枝胶孢炭疽菌菌丝生长有抑制作用，抑制率为62.42％，其中γ-谷氨酰转肽酶对荔枝胶孢炭疽菌的抑菌率占总抑制率的58.25％；3.本专利技术方法工艺简单，易于控制，成本低，具备很好的应用前景。附图说明图1为CF-3培养基优化前后获得的γ-谷氨酰转肽酶对荔枝胶孢炭疽菌的抑菌率对比图。具体实施方式以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本专利技术的优选实施例详述如下：实施例1：在本实施例中，一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，采用保藏号为CCTCCM2016125的枯草芽孢杆菌株Bacillussubti本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ‑谷胺酰转肽酶的方法，其特征在于：采用枯草芽孢杆菌株进行发酵，制备具有抑菌作用的γ‑谷胺酰转肽酶。
【技术特征摘要】
1.一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，其特征在于：采用枯草芽孢杆菌株进行发酵，制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶。2.一种权利要求1所述制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)微生物发酵过程：取液体培养基置于三角瓶中，以枯草芽孢杆菌株与液体培养基的体积比为菌体种子的接种量，按1-10％v/v的接种量接入枯草芽孢杆菌株的菌体种子，在三角瓶中得到发酵原液，进行摇瓶发酵，发酵条件为20-40℃，控制摇瓶转速为100-300rpm，进行发酵培养至少48h，得到发酵液；所述液体培养基包括麦芽糖、玉米粉、酵母膏和无机盐，所述无机盐为质量浓度比为1:5-5:1的MgSO4·7H2O和K2HPO4·3H2O的混合盐；(2)γ-谷胺酰转肽酶的分离和纯化过程：将在所述步骤(1)中制备的发酵液经过离心除去菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得溶菌酶。3.根据权利要求2所述制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，其特征在于：在所述步骤(1)配制的发酵原液中，所述麦芽糖的浓度范围为20-80g/L，所述酵母浸膏浓度范围为10-40g/L，玉米粉浓度范围为1-30g/L。4.根据权利要求3所述制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，其特征在于：在所述步骤(1)配制的发酵原液中，所述麦芽糖的浓度为60g/L，所述酵母浸膏浓度为...
【专利技术属性】
技术研发人员：高海燕，周迎卓，甄超颖，王珂，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：上海,31
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