小麦抗条锈病相关的TXR蛋白及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术涉及小麦抗病领域，具体的涉及一种培育条锈病抗性降低的转基因植物的方法，包括将抑制TXR核苷酸转录的DNA片段导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的条锈病抗性低于所述受体植物。通过病毒诱导的基因沉默和CRISPR/Cas9基因编辑技术，降低TXR基因在小麦叶片中的表达，使抗条锈病的小麦品种水原11对无毒条锈菌小种CYR17的侵染，反应型由0‑1级变为3‑4级。由此证明小麦的TXR基因参与了小麦对条锈菌的抗性调控。

TXR Protein Related to Stripe Rust Resistance in Wheat and Its Coding Gene and Application

【技术实现步骤摘要】
小麦抗条锈病相关的TXR蛋白及其编码基因与应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种与小麦抗条锈病相关的TXR蛋白及其编码基因与应用。
技术介绍
小麦条锈病是由小麦条锈菌侵染引起的一种世界性真菌病害。小麦条锈菌属于柄锈菌属的条形柄锈菌小麦专化型(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)(Zhaoetal.,2016)，是一种活体寄生真菌。条锈病是危害中国及世界小麦生产的严重病害。尽管化学药剂可以有效控制小麦病害造成的经济损失，但出于对环境安全和人类健康的考虑，培育并推广抗病品种依然被认为是最根本、最经济和最安全的途径(LineandChen,1995；Xuetal.,2013)。抗病基因的克隆与功能研究对于小麦抗病分子机制的研究和进行分子抗病育种具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种小麦条锈病抗性相关的基因及其编码蛋白。一种培育条锈病抗性降低的转基因植物的方法，包括将抑制TXR基因转录的物质导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的条锈病抗性低于所述受体植物。其中，所述TXR蛋白具有如序列7或序列8或序列9所述的氨基酸序列。其中，所述TXR蛋白的编码基因具有如序列1或序列2或序列3所述的DNA序列。其中，所述抑制TXR基因转录的物质为：BSMV病毒载体α、BSMV病毒载体β和γ-TXR,所述γ-TXR为γ-TXR-1或γ-TXR-2，所述γ-TXR-1为将序列表中的序列2自5’末端起第109-314位核苷酸的序列按基因表达的相反方向插入BSMV-VIGS病毒载体γ链的NheI酶切位点处，且保持BSMV-VIGS病毒载体γ链的其它序列不变的得到的TXR基因沉默载体,所述γ-TXR-1为将序列表中的序列2自5’末端起第1623-1795位核苷酸的序列按基因表达的相反方向插入BSMV-VIGS病毒载体γ链的NheI酶切位点处，且保持BSMV-VIGS病毒载体γ链的其它序列不变的得到的TXR基因沉默载体。。其中，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统实现抑制受体植物中所述的抑制TXR基因转录，从而实现抑制受体植物中所述TXR蛋白质的含量和/或活性。培育条锈病抗性提高的转基因植物的方法，包括提高受体植物中TXR蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的条锈病抗性高于所述受体植物。其中，所述TXR蛋白具有如序列7或序列8或序9所述的氨基酸序列。其中，所述TXR蛋白的编码基因具有如序列1或序列2或序列3所述的DNA序列。其中，所述转基因植物的条锈病抗性高于所述受体植物体现在：转基因植物的条锈病菌孢子形成或扩展低于受体植物。其中，所述受体植物为单子叶植物，所述单子叶植物具体为小麦。本专利技术所提供的小麦条锈病抗性相关的蛋白，命名为TXR，来源于普通小麦(TriticumaestivumL.)品种水原11，其核苷酸序列与氨基酸序列示于序列表中序列1-3和序列7-9。该基因位于小麦的第三部分同源群染色体上，并分别将来自3A、3B和3D染色体上的TXR基因序列暂命名为TXR-3A-Suwon11、TXR-3B-Suwon11和TXR-3D-Suwon11。通过病毒诱导的基因沉默和CRISPR/Cas9基因编辑技术，降低TXR基因在小麦叶片中的表达，使抗条锈病的小麦品种水原11对无毒条锈菌小种CYR17的侵染，反应型由0-1级变为3-4级。由此证明小麦的TXR基因参与了小麦对条锈菌的抗性调控。附图说明图1为从小麦品种水原11基因组中克隆获得到的3个TXR基因拷贝的KASP标记分型对3个基因拷贝的染色体定位分析。A、B和C分别代表162、643和1245bp位置处的KASP标记分型结果。TXR1、TXR2和TXR3分别代表以以水原11基因组DNA为模板，扩增得到的TXR基因的三个拷贝序列，CS为中国春。红色的三角形表示VIC荧光基团，位于X轴，蓝色的圆形表示FAM荧光基团，位于Y轴，绿色的正方形表示杂合型。×表示分型不明确。图2为BSMV-VIGS下调TXR基因表达后抗条锈病普通小麦品种水原11叶片中TXR基因的相对表达量。图示沉默片段TXR-1和TXR-2均可极显著下调TXR基因的表达(“**”代表P≤0.01)。Mock：模拟接种的空白对照植株；BSMV:GFP：转GFP基因的负对照植株；BSMV:TXR-1和BSMV:TXR-2分别代表利用沉默片段TXR-1和沉默片段TXR-2下调TXR基因表达的植株。图3为下调TXR基因表达的水原11植株失去对条锈菌小种CYR17的抗性，沦为高感(反应型为3～4)。Mock：模拟接种的空白对照植株；BSMV:GFP：转GFP基因的负对照植株；BSMV:TXR-1和BSMV:TXR-2分别代表利用沉默片段TXR-1和沉默片段TXR-2下调TXR基因表达的植株。图4为BSMV-VIGS下调TXR表达后水原11叶片产生H2O2的细胞数目减少A：条锈菌小种CYR17侵染的水原11叶片，箭头示积累活性氧的气孔保卫细胞。B：BSMV-VIGS降低TXR在水原11中的表达后，CYR17侵染时积累活性氧的气孔保卫细胞数量显著减少。C：BSMV-VIGS降低TXR在水原11中的表达后，CYR17侵染时产生活性氧的气孔保卫细胞数量统计结果，与对照Mock和BSMV:GFP相比显著减少。图5为CRISPR/Cas9系统中针对TXR基因的sgRNA活性检测。b1表示靶标TXR基因的sgRNA。-T7E1表示分别以pTaU6-b1载体质粒(b1)转化的原生质体DNA为模板和野生型(WT)原生质体DNA为模板进行PCR扩增得到的TXR基因片段，经变性和复性后未加T7E1酶处理。+T7E1表示分别以pTaU6-b1载体质粒(b1)转化的原生质体DNA为模板和野生型(WT)原生质体DNA为模板进行PCR扩增得到的TXR基因片段，经变性和复性后加T7E1酶处理。红色箭头示突变条带。图6为TXR基因编辑植株的抗条锈病鉴定及其突变类型的测序检测结果。A：TXR基因通过CRISPR/Cas9系统被编辑后，在T1代植株叶片中表达量显著降低。B：TXR基因被编辑突变后，水原11植株失去对条锈菌生理小种CYR17的抗性，沦为高感。C：T1代植株突变类型的测序检测结果。CK：对照植株。38-1和38-4分别表示编号为38的T0代植株自交获得的两个不同的T1代单株。38-1-3A：TXR-3A-Suwon11在38-1株系中的突变类型。38-1-3B：TXR-3B-Suwon11在38-1株系中的突变类型。38-1-3D：TXR-3D-Suwon11在38-1株系中的突变类型。38-4-3A：TXR-3A-Suwon11在38-4株系中的突变类型。38-4-3B：TXR-3B-Suwon11在38-4株系中的突变类型。38-4-3D：TXR-3D-Suwon11在38-4株系中的突变类型。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的定量实验，均设置3次重复，结果取平均值。下述实施例中的BSMV-VIGS病毒载体(包括α、β和γ质粒)和GFP(BSMV:本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种培育条锈病抗性降低的转基因植物的方法，其特征在于，包括抑制受体植物中TXR蛋白的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的条锈病抗性弱于所述受体植物，其中所述TXR蛋白为如序列7所示的氨基酸序列，或序列7所示氨基酸序列经一个或多个氨基酸替换后的序列。

【技术特征摘要】
1.一种培育条锈病抗性降低的转基因植物的方法，其特征在于，包括抑制受体植物中TXR蛋白的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的条锈病抗性弱于所述受体植物，其中所述TXR蛋白为如序列7所示的氨基酸序列，或序列7所示氨基酸序列经一个或多个氨基酸替换后的序列。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述TXR蛋白为如序列7或序列8或序列9所述的氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述TXR蛋白的编码基因为如序列1或序列2或序列3所述的DNA序列。4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述抑制TXR蛋白质表达的物质为:BSMV病毒载体α、BSMV病毒载体β和γ-TXR,所述γ-TXR为γ-TXR-1或γ-TXR-2，所述γ-TXR-1为将序列表中的序列2自5’末端起第109-314位核苷酸的序列按基因表达的相反方向插入BSMV-VIGS病毒载体γ链的NheI酶切位点处，且保持BSMV-VIGS病毒载体γ链的其它序列不变的得到的TXR基因沉默载体,所述γ-TXR-1为将序列表中的序列2自5’末端起第1623-1795位核苷酸的序列按基因表达的相反方向...

【专利技术属性】
技术研发人员：张相岐，刘亚培，范仁春，席海秀，卫波，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11