一种噻吨溴类化合物的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种噻吨溴类化合物的应用，通过建立的WWP1小分子化合物抑制剂体外筛选体系及蛋白酶谱、圆二色谱、体外自泛素化检测实验发现该噻吨溴类化合物能有效抑制泛素连接酶WWP1与泛素结合酶E2的相互作用。通过MTT实验、LC3斑点实验、流式细胞术以及细胞划痕实验研究发现，该噻吨溴类化合物影响肿瘤细胞的细胞生长、细胞自噬、细胞凋亡及细胞迁移能力。这些实验结果表明该噻吨溴类化合物能有效抑制WWP1的泛素连接酶活性，进而影响细胞的多种生命进程，可作为靶向WWP1的抗肿瘤药物。

Application of a Thiotropic Bromide Compound

【技术实现步骤摘要】
一种噻吨溴类化合物的应用
本专利技术涉及一种化合物的应用，尤其是一种噻吨溴类化合物的应用。
技术介绍
在生物体内，蛋白质参与细胞各项生理功能，蛋白质在发挥功能之后，往往需要被及时清除。泛素-蛋白酶体途径和自噬溶酶体途径是生物体细胞中的蛋白质降解的两种主要方式，泛素-蛋白酶体途径能够选择性、特异性的降解丧失功能的蛋白质。泛素化过程除了介导26S蛋白酶体识别并降解蛋白质之外，还与自噬溶酶体途径降解途径相关。细胞中蛋白质的合成与降解平衡与基因转录、蛋白质翻译、信号传导、生长发育等多种生命活动相关，是维持细胞内稳态的重要机制。与泛素-蛋白酶体途径相关的疾病病因主要是该途径中的关键酶或底物的突变(功能丧失)导致疾病相关蛋白积累或加速降解。经过深入研究发现，肿瘤发生的发生与发展伴随着细胞周期异常、抑癌蛋白过度降解、癌蛋白聚集的现象，这种现象与泛素-蛋白酶体途径中关键酶或底物的失活或突变息息相关。因此筛选以泛素-蛋白酶体途径中的关键酶为靶点的小分子抑制剂为相应疾病的治疗提供了新策略，成为了新的研究热点。泛素-蛋白酶体途径中泛素化修饰的泛素链类型以及长短，决定了靶蛋白被蛋白酶体降解或被转移到其他特定部位发挥功能的不同命运。泛素连接酶是确定蛋白质泛素化类型、泛素链长短以及结构的关键酶，在靶蛋白的选择性、特异性识别过程中具有非常重要的作用，因此，泛素连接酶成为近年来研究以及药物开发的重要靶点。WWP1是众多人体中众多泛素连接酶之一，作为一种致癌因子，在一部分前列腺癌、胃癌、乳腺癌细胞和白血病中的过表达。目前已报道的WWP1的靶蛋白有Smad2、ErbB4、KLF2、p27、KLF5、TβRI、p63等。WWP1可以通过降解p27显著抑制p27诱导的复制衰老，通过降解TβRI负向调控TGF-β信号通路，通过降解KLF2、KLF5促进肿瘤的发生发展。总之WWP1的过表达，导致癌症抑制因子过度降解，促进癌症的发生和发展，这使得WWP1成为治疗相关癌症的靶点。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种噻吨溴类化合物的应用。本专利技术采用的技术方案是：一种噻吨溴类化合物，其特征在于：为1-Hexadecanaminium,N-[2-[[(4-methoxyphenyl)methyl]-2-pyrimidinylamino]ethyl]-N,N-dimethyl-,bromide(1:1)，具有式(I)所示结构：上述噻吨溴类化合物的筛选方法，具体步骤如下：(1)包被泛素结合酶：将待包被蛋白用碳酸盐包被缓冲液稀释至80ng/100μL，混匀后按照每孔100μL加入到96孔板中，37℃孵育2h或4℃过夜孵育，使蛋白附着到孔板底部；(2)5％脱脂牛奶封闭：将96孔板中牛奶倒掉，加入200μLPBST洗涤缓冲液,水平摇床振荡5min，倒掉并拍净孔内的液体，用PBST重复洗涤4次；80ng/100μL每孔加入150μL用PBS缓冲液配制的5％脱脂牛奶，37℃封闭2h；(3)WWP1与泛素结合酶共孵育：将96孔板中牛奶倒掉，加入200μLPBST洗涤缓冲液,水平摇床振荡5min，倒掉并拍净孔内的液体，用PBST重复洗涤4次；用PBS缓冲液将WWP1蛋白稀释至364ng/100μL混匀，取300μL蛋白液将小分子化合物稀释至5μmol/L，孵育10min后按照每孔100μL加入到96孔板中，37℃孵育2h；(4)一抗孵育：将96孔板中液体倒掉，加入120μLPBST洗涤缓冲液,水平摇床振荡5min，倒掉并拍净孔内的液体，用PBST重复洗涤4次；将用PBS稀释的一抗按照每孔100μL加入96孔板中，37℃孵育2h；(5)二抗孵育：将96孔板中的一抗倒掉，加入120μLPBST洗涤缓冲液，水平摇床振荡5min，倒掉并拍净孔内的液体，用PBST重复洗涤4次；将用PBS稀释好的HRP二抗按照每孔100μL加入96孔板中，37℃避光孵育30min-1h；(6)显色：将96孔板中的二抗倒掉，加入120μLPBST洗涤缓冲液，水平摇床振荡5min，倒掉并拍净孔内的液体，PBST洗涤3次后换用PBS洗涤一次；将TMB显色液的A液和B液等体积混合后(现用现配)，按每孔100μL加入96孔板中；(7)终止：待酶标孔内液体蓝色差异最大时，加入100μL2mol/L的硫酸终止反应；(8)检测：用酶标仪检测各孔的OD450值。上述噻吨溴类化合物在制备WWP1抑制剂方面的应用。所述噻吨溴类化合物能够有效抑制WWP1与泛素结合酶的相互作用、抑制WWP1介导的泛素化过程。上述噻吨溴类化合物在制备WWP1诱导的相关疾病的药物方面的应用。优选的，上述噻吨溴类化合物的应用，所述疾病为肿瘤疾病。优选的，上述噻吨溴类化合物的应用，所述疾病为乳腺癌。所述噻吨溴类化合物能够有效抑制癌细胞的生长和迁移。所述噻吨溴类化合物能有效抑制自噬降解途径，能有效积累癌细胞中自噬相关蛋白LC3。所述噻吨溴类化合物能够有效诱导癌细胞凋亡。本专利技术的有益效果是：上述噻吨溴类化合物，能有效抑制WWP1与泛素结合酶的相互作用，抑制WWP1介导的泛素化过程。通过MTT实验、LC3斑点实验、流式细胞术以及细胞划痕实验研究发现，上述噻吨溴类化合物能够影响癌细胞的生长、自噬、凋亡及迁移能力。上述噻吨溴类化合物能有效抑制WWP1介导的蛋白质降解过程，进而影响细胞的多种生命进程，可作为靶向WWP1的全新抗肿瘤药物。附图说明图1为本专利技术WWP1小分子抑制剂筛选体系筛选获得本专利技术所述噻吨溴类化合物的结果。结果说明，编号为S4355的化合物即为本专利技术所述的噻吨溴类化合物能有效抑制WWP1与泛素结合酶的相互作用。图2为本专利技术自泛素化实验检测本专利技术所述噻吨溴类化合物对WWP1自泛素化影响的结果。结果说明，编号为S4355的化合物即为本专利技术所述噻吨溴类化合物能有效抑制WWP1的自泛素化。图3为本专利技术MTT实验检测本专利技术所述噻吨溴类化合物对癌细胞生长影响的结果。结果说明，编号为S4355的化合物即为本专利技术所述的噻吨溴类化合物能有效抑制癌细胞活力；图4为本专利技术细胞划痕实验检测本专利技术所述噻吨溴类化合物对癌细胞迁移影响的结果。结果说明，编号为S4355的化合物即为本专利技术所述的噻吨溴类化合物能有效抑制癌细胞迁移。图5为本专利技术GFP-LC3斑点实验检测本专利技术所述噻吨溴类化合物对癌细胞自噬影响的结果。结果说明，编号为S4355的化合物即为本专利技术所述的噻吨溴类化合物能抑制自噬降解途径；图6为本专利技术流式细胞术检测本专利技术所述噻吨溴类化合物对癌细胞凋亡影响的结果。结果说明，编号为S4355的化合物即为本专利技术所述的噻吨溴类化合物能诱导癌细胞凋亡。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进一步说明，但实施例不限制本专利技术的保护范围。实施例1(1)噻吨溴类化合物的筛选①包被泛素结合酶：将待包被蛋白His-HA-UbcH7用碳酸盐包被缓冲液稀释至80ng/100μL，混匀后按照每孔100μL加入到96孔板中，37℃孵育2h或4℃过夜孵育，使蛋白附着到孔板底部；②5％脱脂牛奶封闭：将96孔板中牛奶倒掉，加入200μLPBST洗涤缓冲液,水平摇床振荡5min，倒掉并拍净孔内的液体，用PBST重复洗涤4次；每孔加入150μL用PBS缓冲液配制的5％脱脂牛奶，37℃封闭2h本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种噻吨溴类化合物在制备WWP1抑制剂方面的应用，所述噻吨溴类化合物具有式(I)所示结构：

【技术特征摘要】
1.一种噻吨溴类化合物在制备WWP1抑制剂方面的应用，所述噻吨溴类化合物具有式(I)所示结构：2.权利要求1所述噻吨溴类化合物在制备WWP1诱导的相关疾病的药物...

【专利技术属性】
技术研发人员：刁爱坡，李玉银，王啊丽，谭梅雪，李欣茹，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12