一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法技术

本发明专利技术公开了一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：制备粪菌液：将来源于临床确诊为儿童自闭症患者的粪便制成粪菌液；模型建立：将粪菌液采用灌肠法注入孕鼠，孕鼠随后分娩得到仔鼠即为自闭症模型鼠。本发明专利技术公开的方法可重复性强、成功率高、死亡率低、模型症状更典型、更持久、成本低，具有实际价值和意义。

A Method of Establishing Autism Rat Model by Fecal Bacteria Transplantation

【技术实现步骤摘要】
一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法
本专利技术涉及建立动物自闭症模型
，更具体的说是涉及一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法。
技术介绍
目前，自闭症谱系障碍(ASD)是一种较为严重的神经系统发育障碍性疾病，多发生于婴幼儿时期，其典型特征为交流障碍和想象障碍、社会功能障碍、刻板的重复兴趣和行为、并伴有运动协调障碍。据美国疾病控制中心最新数据显示,至2018年,ASD的发生率已从2014年的1/68上升至1/59。有文献报道我国约有400～1000万自闭症患者,其中儿童患病人数约为100～300万。现阶段研究表面自闭症谱系障碍可能与遗传、感染与免疫、神经发育、环境和心理因素有关，但是其机制不明，发病率又高、无特效药物，因此近年来受到越来越广泛的关注。动物模型是研究神经精神类疾病的重要手段之一,其发展为探讨疾病的生物学机制提供了广阔的前景。因此建立一种成功的自闭症模型可以帮助我们对自闭症的病理机制进行进一步的准确阐释,同时还可以为自闭症的治疗提供一定的理论依据。但是由于ASD病因复杂，发病机制尚不明确，故也缺乏严格意义的动物模型以供实验研究。从国内外研究现状分析来看，近年来ASD动物模型的建立方法有很多种并且取得了新的进展，但仍存在一些缺陷，如模型制备耗时长、操作过于复杂、可重复性差、科研成本高及科研设备要求严格,不能广泛推广等。大致可以分为以下几类：⑴神经毒理学模型，分为丙戊酸(VPA)模型、丙酸(PPA)模型、抗体模型、七氟醚模型、病毒模型、毛果芸香碱模型；⑵遗传学模型，分为15q11-13染色体异常模型、NRCAM缺失模型、engrailed-2敲除小鼠模型、GABRB3基因缺失模型等；⑶其它还有反复冷冻刺激模型、精液素-1α缺失模型等。因此，提供一种建立自闭症大鼠模型的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法，该方法可重复性强，成功率高，死亡率低、模型症状更典型、更持久、成本低，具有实际价值和意义。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)制备粪菌液：将来源于临床确诊为儿童自闭症患者的粪便制成粪菌液；(2)模型建立：将粪菌液采用灌肠法注入孕鼠，孕鼠随后分娩得到仔鼠即为自闭症模型鼠。上述优选技术方案的有益效果是：本专利技术公开的建立自闭症大鼠模型的方法操作简单，设备要求低，容易实施；并且，采用本专利技术公开的方法，仔鼠死亡率低，模型更典型更持久；同时采用本专利技术公开的方法可为后期自闭症致病机制探讨提供参考。优选的，所述步骤(1)具体包括如下步骤：A、将来源于临床确诊为儿童自闭症患者的粪便加入到无菌生理盐水中，搅拌均匀后过滤，得到滤液；B、将上述得到的滤液进行离心处理，弃上清；C、将剩余物加入至生理盐水中悬浮得到粪菌液。上述优选技术方案的有益效果：本专利技术公开的方法配制的粪菌液浓度适中，移植效果较好；使得到的粪菌液尽可能多的保留样本中的不溶成分。优选的，所述步骤A在无菌工作台中称量来源于临床确诊为儿童自闭症患者的粪便，然后按照无菌生理盐水：粪便＝4～6mL/g加入至无菌生理盐水中。优选的，来源于临床确诊为儿童自闭症患者的粪便按照无菌生理盐水：粪便＝5mL/g加入至无菌生理盐水中。上述优选技术方案的有益效果：本专利技术在无菌台上操作可以避免粪菌制备过程中混入外来菌；并且，设定无菌生理盐水：粪便＝4～6mL/g可以确保样品中的成分充分溶解，保证经过过滤后滤出液适量，以满足后续操作。优选的，所述步骤A中过滤时将搅拌后的混合物依次通过孔径为2.0㎜、1.0㎜、0.5㎜和0.25㎜的四种无菌不锈钢滤网。上述优选技术方案的有益效果是：本专利技术采用孔径由大到小的筛网逐级过滤可以确保滤过速度和滤过率。优选的，所述步骤B中离心时将滤液以3000r/min转速离心，然后弃上清液，向剩余物中继续加入生理盐水至原体积，重复离心三次。上述优选技术方案的有益效果是：本专利技术通过离心分离可使样本中的菌群彻底从附着物上游离出来；并且可除去除菌群以外的其他物质。优选的，所述步骤C中将得到的沉淀物称量后加入至生理盐水中悬浮，得到浓度为3～5g/mL的粪菌液。优选的，所述步骤C中将得到的沉淀物称量后加入至生理盐水中悬浮，得到浓度为5g/mL的粪菌液上述优选技术方案的有益效果是：本专利技术得到的3～5g/mL的粪菌液中菌群含量适中，易于移植后的菌群定植；并且，该浓度的粪菌液可使移植量处于宿主的耐受范围。优选的，所述步骤(1)中粪便来源于确诊为重度儿童自闭症患者。上述优选技术方案的有益效果是：选择来源于确诊为重度儿童自闭症患者的粪便，可以保证来源粪便具有足量的自闭症特征菌群。优选的，所述步骤(2)中在受孕0.5d至仔鼠出生后21天断奶期间，将粪菌液采用灌肠法注入孕鼠。上述优选技术方案的有益效果是：由于胎儿和幼儿肠道菌群主要来自于母亲，本专利技术在孕期和哺乳期进行菌群移植可以保证仔鼠的肠道内有丰富的自闭症特征菌群定植。优选的，所述步骤(2)中灌肠法具体是用无菌软导管从肛门缓慢插进8～10cm，然后通过无菌软导管注入粪菌液。上述优选技术方案的有益效果是：由于大鼠从肛门处到结肠位置的距离约为8-10cm，本专利技术将无菌软导管从肛门缓慢插进8～10cm可以将粪菌液注入结肠，而菌移植到结肠位置更容易定植。优选的，所述步骤⑵中粪菌液的灌肠量为0.1～0.5mL/100g，每日两次，隔天进行。上述优选技术方案的有益效果是：本专利技术将灌肠量设定为0.1～0.5mL/100g，可以保证移植后的自闭症特征菌群在肠道内有一定存量，易于其繁殖为优势菌群。优选的，所述步骤(2)中注入粪菌液时边注边向外拔出导管。上述优选技术方案的有益效果是：本专利技术在灌肠过程中边注边向外拔出导管可使移植粪菌液在结肠位置均匀喷洒，易于其定植，并且可减轻移植时结肠段的肠壁承受压力，保护肠壁。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法，具有如下有益效果：(1)本专利技术公开的方法能够成功的建立自闭症大鼠模型，而且可重复性强，成功率高，模型症状更典型、更持久，具有实用性；(2)同时，本专利技术公开的方法建立自闭症大鼠模型死亡率低，而且成本低、操作简单，具有普遍试用性。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术实施例公开了一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法，具体包括如下步骤：(1)制备粪菌液：A、在无菌工作台中称量来源于临床确诊为儿童自闭症患者的粪便，然后按照无菌生理盐水：粪便＝5mL/g加入至无菌生理盐水中；搅拌均匀后过滤，得到滤液；过滤时将搅拌后的混合物依次通过孔径为2.0㎜、1.0㎜、0.5㎜和0.25㎜的四种无菌不锈钢滤网；B、将上述得到的滤液进行离心处理，弃上清液；离心时将滤液以3000r/min转速离心15min，然后弃上清液，向沉淀物中继续加入生理盐水至原体积，重复离心三次；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)制备粪菌液：将来源于临床确诊为儿童自闭症患者的粪便制成粪菌液；(2)模型建立：将粪菌液采用灌肠法注入孕鼠，孕鼠随后分娩得到仔鼠即为自闭症模型鼠。

【技术特征摘要】
1.一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)制备粪菌液：将来源于临床确诊为儿童自闭症患者的粪便制成粪菌液；(2)模型建立：将粪菌液采用灌肠法注入孕鼠，孕鼠随后分娩得到仔鼠即为自闭症模型鼠。2.根据权利要求1所述的一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括如下步骤：A、将来源于临床确诊为儿童自闭症患者的粪便加入到无菌生理盐水中，搅拌均匀后过滤，得到滤液；B、将上述得到的滤液进行离心处理，弃上清液；C、将剩余物加入至生理盐水中悬浮得到粪菌液。3.根据权利要求2所述的一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法，其特征在于，所述步骤A在无菌工作台中称量来源于临床确诊为儿童自闭症患者的粪便，然后按照无菌生理盐水：粪便＝4～6mL/g加入至无菌生理盐水中。4.根据权利要求3所述的一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法，其特征在于，所述步骤A中过滤时将搅拌后的混合物依次通过孔径为2.0㎜、1.0㎜、0.5㎜和0.25㎜的四种无菌不锈钢滤网。5.根据权利要求2所述的一种运用粪菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨丽萍，亓照耀，袁海燕，刘娟，翟林林，曹赟，吕梦珂，王洪刚，王启阳，
申请(专利权)人：河南中医药大学，
类型：发明
国别省市：河南,41