双抗原表位融合基因重组慢病毒载体、抗原提呈细胞和CTL细胞及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了双抗原表位融合基因重组载体、抗原提呈细胞和CTL细胞及其构建方法和应用，属于肿瘤药物技术领域。双抗原表位融合基因重组慢病毒载体，包括由MAGE‑A3基因和KRAS突变基因形成的融合基因。将所述重组病毒载体包装成重组慢病毒后，以所述重组慢病毒为介导载体将双抗原编码基因导入DC细胞的基因组中，得到同时提呈MAGE‑A3和KRAS突变双抗原的抗原提呈细胞。利用DC‑CTL技术用所述抗原提呈细胞诱导T细胞，得到靶向MAGE‑A3和KRAS突变的特异性CTL细胞。基于所述CTL细胞具有较强的双抗原杀伤作用，用于制备治疗癌症或肿瘤的药物。

Construction and application of recombinant lentivirus vector, antigen presenting cells and CTL cells fused with double antigen epitopes

【技术实现步骤摘要】
双抗原表位融合基因重组慢病毒载体、抗原提呈细胞和CTL细胞及其构建方法和应用
本专利技术属于肿瘤药物
，具体涉及双抗原表位融合基因重组载体、抗原提呈细胞和CTL细胞及其构建方法和应用。
技术介绍
MAGE-A3作为一种内源性肿瘤抗原，在细胞内生成后被降解成小分子多肽，并与MHC(主组织相容性复合体)分子结合形成复合物，被呈递到细胞表面。MAGE-A3蛋白在多种肿瘤类型中均有表达，包括黑色素瘤，以及其他固体肿瘤如胃癌、肺癌、食道癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌等。对于上述疾病的治疗，可以采用化疗和放射性治疗等方法，但都会对自身的正常细胞造成损害。KRAS基因是ras基因家族中一种，与人类肿瘤相关的基因。KRAS参与细胞内信号传递，当KRAS基因突变时，该基因永久活化，不能产生正常的ras蛋白，使细胞中信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。有效识别突变后KRAS基因表达的抗原，对癌症的治疗具有重要意义。肿瘤的治疗手段包括手术、放疗、化疗、靶向治疗和免疫治疗。一般传统的肿瘤治疗手段都是采用手术治疗。这种治疗方法，对肿瘤没有扩散的情况下采取的积极治疗手段，但是对于患者的伤害过大。放疗和化疗是针对已经扩散的肿瘤进行的治疗手段，但是对患者的身体和心理都会造成较大的伤害。目前靶向药物治疗越来越受到关注，它通过与癌症发生、肿瘤生长所必需的特定分子靶点的作用来阻止癌细胞的生长。靶向药物的特点决定了其尤其适合身体虚弱的晚期患者使用。免疫治疗是激发或调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞。目前治疗用的瘤苗主要有肿瘤细胞瘤苗、基因工程疫苗、抗独特型抗体瘤苗、抗原提呈细胞为基础的瘤苗。DC-CTL技术，免疫治疗的一种方法，是利用DC和抗肿瘤效应细胞(T淋巴细胞)两种细胞联合协同治疗肿瘤。通过DC的抗原递呈，激活T淋巴细胞，生成机体抗肿瘤最重要的并赋予抗肿瘤特异性的效应细胞—细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。CTL识别递呈发生在肿瘤细胞表面并与Mainhistologiccomplex(MHC)-I类分子结合的抗原肽片段，通过分泌型杀伤(胞吐颗粒释放效应分子如穿孔素、颗粒酶、淋巴毒素、TNF相关蛋白等引起靶细胞裂解或凋亡)或非分泌型杀伤(表达FasL和TRAIL与靶细胞表面的相应受体分子结合，启动信号转导途径而诱导凋亡)途径杀伤肿瘤细胞。虽然CTL具有特异性和相对较高效的杀瘤效应，但存在MHC限制性，据报道25％～75％的肿瘤细胞有不同形式的人白细胞抗原(HLA)表型改变，导致免疫识别障碍，为肿瘤免疫逃逸的主要原因之一；同时CTL的特异性杀伤效应虽然相对较高，但有限的靶向性只能杀死小部分肿瘤细胞，这些缺陷都严重限制了以CTL为基础的肿瘤免疫治疗的疗效。因此，增强针对肿瘤细胞的靶向杀伤效应、提高对肿瘤细胞的多靶点作用是目前免疫治疗研究的难题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种增强对肿瘤细胞的靶向杀伤效应、提高对肿瘤细胞的多靶点作用的重组慢病毒载体、抗原提呈细胞和CTL细胞及其构建方法和应用。本专利技术提供了双抗原表位融合基因重组慢病毒载体，包括由MAGE-A3基因和KRAS突变基因形成的融合基因；其中MAGE-A3基因和KRAS突变基因之间没有连接顺序；所述KRAS突变基因中对应的氨基酸突变后蛋白质包括KRAS-G12D、KRAS-G12C、KRAS-G12V、KRAS-G12A、KRAS-G12S、KRAS-G13D和KRAS-Q61H中的一种。优选的，所述KRAS-G12D的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示；所述KRAS-G12C的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示；所述KRAS-G12V的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示；所述KRAS-G12A的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示；所述KRAS-G12S的氨基酸序列如SEQIDNo.6所示；所述KRAS-G13D的氨基酸序列如SEQIDNo.7所示；所述KRAS-Q61H的氨基酸序列如SEQIDNo.8所示。优选的，所述MAGE-A3基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术提供了一种同时提呈MAGE-A3和KRAS突变双抗原的抗原提呈细胞的构建方法，包括以下步骤：A.将所述重组慢病毒载体、慢病毒包装质粒、培养基和转染试剂混合，静置，得到转染液；B.向含T细胞的培养基中逐滴加入所述转染液，培养6～7h，更换含体积浓度10％FBS的DEME培养基继续培养，收集上清液；C.将所述上清液浓缩，用得到的病毒浓缩液感染DC细胞，得到同时提呈MAGE-A3和KRAS突变双抗原的抗原提呈细胞。优选的，所述病毒浓缩液感染DC细胞的感染复数为5:1。本专利技术提供的所述构建方法构建得到的抗原提呈细胞，在所述抗原提呈细胞的基因组中包含由MAGE-A3基因和KRAS突变基因形成的融合基因。本专利技术提供了靶向MAGE-A3和KRAS突变的特异性CTL细胞的构建方法，包括以下步骤：(1)分离筛选得到表面表达CD8或CD3的T细胞；(2)用所述抗原提呈细胞或所述构建方法构建得到的抗原提呈细胞和步骤(1)中得到的T细胞混合，得到的培养体系进行共培养；(3)共培养2d后，每天向所述共培养液中添加IL-2，继续共培养，当培养液变黄时进行半量换液，共培养持续到21～22d时，收获的细胞即为特异性CTL。优选的，所述抗原提呈细胞和T细胞的比例为1:100～500；所述T细胞的浓度为1×106/mL；所述抗原提呈细胞的浓度为1×106/mL。本专利技术提供了所述的靶向MAGE-A3和KRAS突变的特异性CTL细胞。本专利技术还提供了所述的特异性CTL细胞在制备治疗癌症或肿瘤药物中的应用。本专利技术提供的双抗原表位融合基因重组慢病毒载体，包括由MAGE-A3基因和KRAS突变基因形成的融合基因。本专利技术以慢病毒质粒为基础表达载体，将所述融合基因插入到慢病毒质粒中，得到同时表达MAGE-A3和KRAS突变蛋白质的重组载体，为后续构建具有双抗原特异性CTL做准备。本专利技术提供了一种同时提呈MAGE-A3和KRAS突变双抗原的抗原提呈细胞及其构建方法，本专利技术以慢病毒为介导载体，将MAGE-A3基因和KRAS突变基因形成的融合基因导入到抗原提呈细胞的基因组中，获得稳定遗传表达体系，构建得到的抗原提呈细胞可以同时提呈MAGE-A3和KRAS突变双抗原，增加识别抗原的种类，应用范围更广。本专利技术提供了所述的靶向MAGE-A3和KRAS突变的特异性CTL细胞及其构建方法，制备的CTL细胞对MAGE-A3和KRAS突变抗原具有特异性，能够靶向杀伤具有MAGE-A3抗原和/或KRAS突变抗原的肿瘤细胞的作用。实验证明：与单独靶向MAGE-A3的CTL相比，同时靶向MAGE-A3和KRAS突变的CTL，对MAGE-A3和KRAS突变双阳的肿瘤细胞的杀伤能力更高。基于所述特异性CTL细胞的杀伤作用，将所述CTL细胞为肿瘤或癌症的免疫治疗提供了新方法。附图说明图1为PCR检测不同MAGE-A3-KRAS突变的融合基因；图2为流式检测靶向MAGE-A3-G12D的CTL的细胞表型；图3为流式检测靶向MAGE-A3-G12C的CTL的细胞表型；图4为流式检测靶向MAGE-A3-G12V的CTL的细胞表型；图5为流式本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.双抗原表位融合基因重组慢病毒载体，其特征在于，包括由MAGE‑A3基因和KRAS突变基因形成的融合基因；其中MAGE‑A3基因和KRAS突变基因之间没有连接顺序；所述KRAS突变基因中对应的氨基酸突变后蛋白质包括KRAS‑G12D、KRAS‑G12C、KRAS‑G12V、KRAS‑G12A、KRAS‑G12S、KRAS‑G13D和KRAS‑Q61H中的一种。

【技术特征摘要】
1.双抗原表位融合基因重组慢病毒载体，其特征在于，包括由MAGE-A3基因和KRAS突变基因形成的融合基因；其中MAGE-A3基因和KRAS突变基因之间没有连接顺序；所述KRAS突变基因中对应的氨基酸突变后蛋白质包括KRAS-G12D、KRAS-G12C、KRAS-G12V、KRAS-G12A、KRAS-G12S、KRAS-G13D和KRAS-Q61H中的一种。2.根据权利要求1所述重组慢病毒载体，其特征在于，所述KRAS-G12D的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示；所述KRAS-G12C的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示；所述KRAS-G12V的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示；所述KRAS-G12A的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示；所述KRAS-G12S的氨基酸序列如SEQIDNo.6所示；所述KRAS-G13D的氨基酸序列如SEQIDNo.7所示；所述KRAS-Q61H的氨基酸序列如SEQIDNo.8所示。3.根据权利要求1或2所述重组慢病毒载体，其特征在于，所述MAGE-A3基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。4.一种同时提呈MAGE-A3和KRAS突变双抗原的抗原提呈细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：A.将权利要求1～3任意一项所述重组慢病毒载体、慢病毒包装质粒、培养基和转染试剂混合，静置，得到转染液；B.向含T细胞的培养基中逐滴加入所述转染液，培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦顺昌，张嵘，周子珊，
申请(专利权)人：北京鼎成肽源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11