扩增骨髓间充质干细胞的方法、培养基及应用技术

本发明专利技术生物工程技术领域，具体涉及一种扩增骨髓间充质干细胞的方法、培养基及其应用。该扩增骨髓间充质干细胞的方法包括利用bFGF和VEGF处理所述骨髓间充质干细胞，以便扩增所述骨髓间充质干细胞。该培养基中添加有bFGF和VEGF。利用本发明专利技术所提供的方法所培养的骨髓间充质干细胞不仅能使细胞的增殖能力增加，保持细胞的生物特性和功能，而且能够提高细胞表面分子CD105的表达率，从而可以用于移植治疗急性心肌梗死、慢性心肌梗死以及心脏衰竭引起的缺血性心脏病。

【技术实现步骤摘要】
扩增骨髓间充质干细胞的方法、培养基及应用
本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种扩增骨髓间充质干细胞的方法、培养基及应用。
技术介绍
骨髓间充质干细胞(bone-marrowmesenchymalstemcells，BMSCs)是存在于骨髓中的一群异质性细胞，它具有自我更新能力和多向分化的潜能，可以分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞、内皮细胞等，并能形成多种结缔组织，如骨骼肌、肌腱、韧带、真皮、脂肪和骨髓基质等，在组织再生、创伤修复以及多种疾病的治疗中都有着巨大的潜力。BMSCs是目前研究较为深入的一类成体干细胞。体外培养的BMSCs在形态上呈梭形或纺锤形，生长方式一般为漩涡状、鱼群样生长。多项研究表明，体外分离得到的BMSC是多种细胞混杂的细胞群，其表面抗原也不具有均一性，它能够表达表皮干细胞、内皮细胞、间充质干细胞的表面标志物，如CD166,CD54,CD102,CD44,CD106等，还表达CD90,CD105等。但不表达造血干细胞的表面标志物，如CD34,CD45,CD14,CD3,CD4,CD8等，也不表达主要组织相容性复合物类分子，如HLA-DR抗原等。CD105是一种内皮细胞增殖的标志物为间充质干细胞的特征性表型，也是转化生长因子β(TGFβ)受体复合物的成分之一，与TGF-β1有较高的亲和力，可与TGF-β受体I组成功能性的受体复合物，参与调节细胞的增值与分化。TGF-β在体外可以抑制内皮细胞的生长，而在体内却可通过结合炎症细胞诱导其释放血管生成因子刺激内皮细胞分裂增殖。研究表明CD105在活性血管生成区高表达，因此，CD105不仅调节细胞对TGF-β的反应，也促进血管的形成。目前在对BMSCs的基础研究与临床应用研究中，都需要大量的具有良好生物活性和功能的细胞。然而，BMSCs在骨髓内的含量很少，且随着供者年龄的增长，BMSCs在体内的数量逐渐减少，在体外的常规培养过程中出现增殖能力下降，生物活性及功能变差的状况，这在一定程度上限制了对BMSCs更深入的研究与临床应用。因此，需要一种新的体外培养方法以获得足量的、生物特性和功能都更好的BMSCs。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种扩增骨髓间充质干细胞的方法、培养基及其应用。本专利技术的目的是提供了一种快速地分离、扩增骨髓间充质干细胞并获得活性高、状态佳的骨髓间充质干细胞的新方法，即一种经培养基中添加bFGF和VEGF两个因子联合处理来扩增骨髓间充质干细胞的新方法。具体而言，本专利技术提供了如下技术方案：根据本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种扩增骨髓间充质干细胞的方法，包括：利用bFGF和VEGF处理所述骨髓间充质干细胞，以便扩增所述骨髓间充质干细胞。细胞因子bFGF是重要的促有丝分裂因子，也是形态发生和分化的诱导因子，其主要生物学作用包括作为血管生长因子、促进创伤愈合与组织修复、促进组织再生以及参与神经再生等；细胞因子VEGF是一种血管内皮细胞的特异性有丝分裂原，其可促进血管内皮细胞的增殖，诱导血管的形成，它们不仅能够有效的促进骨髓间充质干细胞的快速增殖，保持良好的细胞状态，而且可以诱导骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞、促进血管增生。利用bFGF和VEGF两种因子联合处理骨髓间充质干细胞，所扩增出来的细胞不仅增殖能力强，保持较高的生物学特性和功能，所获得的细胞更接近体内的BMSCs细胞，而且能够提高细胞表面分子CD105的表达率。根据本专利技术的实施例，以上所述扩增骨髓间充质干细胞的方法可以进一步包括如下技术特征：在本专利技术的一些实施例中，所述bFGF的浓度为1～50ng/ml，任选为2～20ng/mL，例如为5ng/mL，所述VEGF的浓度为1～50ng/mL，任选为2～20ng/mL，例如为5ng/mL。在该浓度下处理骨髓间充质干细胞，能够在短时间内扩增生物学性能良好的骨髓间充质干细胞。在本专利技术的一些实施例中，利用含有bFGF和VEGF的培养基培养所述骨髓间充质干细胞，以便扩增所述骨髓间充质干细胞。在本专利技术的一些实施例中，所述培养为在温度为36～38摄氏度，CO2的体积浓度为4.5～5.5％、常氧条件下进行的。本文中“常氧”是指细胞培养对于氧气的通常需求，例如氧气的体积浓度一般在95％左右。在本专利技术的一些实施例中，所述培养基进一步包括：基础培养基、FBS和谷氨酰胺。在本专利技术的一些实施例中，所述基础培养基选自α-MEM、LDMEM培养基、RPMI1640培养基中的至少一种。在本专利技术的一些实施例中，所述谷氨酰胺是以水溶液的形式提供的，所述谷氨酰胺的水溶液中，所述谷氨酰胺的浓度为200mM/L，基于所述培养基的总体积，所述基础培养基的体积分数为89％，所述FBS的体积分数为10％，所述谷氨酰胺的水溶液的体积分数为1％。在本专利技术的一些实施例中，所述骨髓间充质干细胞为P5代骨髓间充质干细胞，所述P5代骨髓间充质干细胞是通过将原代骨髓间充质干细胞进行接种和预扩增处理后获得的第五代骨髓间充质干细胞。在本专利技术的一些实施例中，用于所述接种和预扩增处理的培养基包括基础培养基、青链霉素和FBS。在本专利技术的一些实施例中，经扩增的骨髓间充质干细胞密度达到85％～95％时，所述骨髓间充质干细胞表面分子CD105的表达率大于50％。其中，CD105表达率指的是能够表达CD105的骨髓间充质干细胞占总的骨髓间充质干细胞的比值。根据本专利技术的第二方面，本专利技术提供了一种扩增骨髓间充质干细胞的方法，包括：将原代骨髓间充质干细胞进行接种处理，以便获得第五代骨髓间充质干细胞，所述原代骨髓间充质干细胞的接种密度为2×105/cm2；在温度为37摄氏度，CO2体积浓度为5％，常氧条件下，将所述第五代骨髓间充质干细胞在含有bFGF和VEGF的培养基中培养，以便扩增所述骨髓间充质干细胞；其中所述培养基由α-MEM、FBS和谷氨酰胺水溶液制备而成，所述谷氨酰胺水溶液中，所述谷氨酰胺的浓度为200mM/L，基于所述培养基的总体积，所述α-MEM的体积分数为89％，所述FBS的体积分数为10％，所述谷氨酰胺水溶液的体积分数为1％。根据本专利技术的第三方面，本专利技术提供了一种扩增骨髓间充质干细胞的系统，包括：接种装置，所述接种装置用于将原代骨髓间充质干细胞进行接种处理；预扩增处理装置，所述预扩增处理装置与所述接种装置相连，所述预扩增处理装置用于将所述接种处理后的所述原代骨髓间充质干细胞进行预扩增处理，以便获得第五代骨髓间充质干细胞；扩增处理装置，所述扩增处理装置与所述预扩增处理装置相连，所述扩增装置利用bFGF和VEGF处理所述骨髓间充质干细胞，以便扩增所述骨髓间充质干细胞。本专利技术提供的扩增骨髓间充质干细胞的细胞，通过相互相连的接种装置、预扩增处理装置和扩增处理装置，能够将从体内分离获得的原代骨髓间充质干细胞依次进行接种、预扩增处理，获得第五代骨髓间充质干细胞，对第五代骨髓间充质干细胞利用bFGF和VEGF处理，获得生物学性能良好的骨髓间充质干细胞。而且在扩增处理的过程中，借助于各装置自身的参数和设定值，能够在尽量减少人为操作的情况下，实现骨髓间充质干细胞的自动化扩增。本文中“接种装置”、“预扩增处理装置”、“扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种扩增骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，包括：利用bFGF和VEGF处理所述骨髓间充质干细胞，以便扩增所述骨髓间充质干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种扩增骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，包括：利用bFGF和VEGF处理所述骨髓间充质干细胞，以便扩增所述骨髓间充质干细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述bFGF的浓度为1～50ng/mL，任选为2～20ng/mL，例如为5ng/mL，所述VEGF的浓度为1～50ng/mL，任选为2～20ng/mL，例如为5ng/mL。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，利用含有bFGF和VEGF的培养基培养所述骨髓间充质干细胞，以便扩增所述骨髓间充质干细胞；任选地，所述培养是在温度为36～38摄氏度，CO2的体积浓度为4.5～5.5％、常氧条件下进行的；任选地，所述培养基进一步包括：基础培养基、FBS和谷氨酰胺；任选地，所述基础培养基选自α-MEM、LDMEM培养基、RPMI1640培养基中的至少一种；任选地，所述谷氨酰胺是以水溶液的形式提供的，所述谷氨酰胺的水溶液中，所述谷氨酰胺的浓度为200mM/L，基于所述培养基的总体积，所述基础培养基的体积分数为89％，所述FBS的体积分数为10％，所述谷氨酰胺的水溶液的体积分数为1％。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞为P5代骨髓间充质干细胞，所述P5代骨髓间充质干细胞是通过将原代骨髓间充质干细胞进行接种和预扩增处理后获得的第五代骨髓间充质干细胞；任选地，用于所述接种和预扩增处理的培养基包括基础培养基、青链霉素和FBS。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，经扩增的骨髓间充质干细胞密度达到85％-95％时，所述骨髓间充质干细胞表面分子CD105的表达率大于50％。6.一种扩增骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，包括：将原代骨髓间充质干细胞进行接种处理，以便获得第五代骨髓间充质干细胞，所述原代骨髓间充质干细胞的接种密度为2×105/cm2；在温度为37摄氏度，CO2体积浓度为5％，常氧条件下，将所述第五代骨髓间充质干细胞在含有bFGF和VEGF的培养基中培养，以便扩增所述骨髓间充质干细胞；其中所述培养基由α-MEM、FBS和谷氨酰胺水溶液制备而成，所述谷氨酰胺水溶液中，所述谷氨酰胺的浓度为200mM/L，基于所述培养基的总体积，所述α-MEM的体积分数为89％，所述FBS的体积分数为10％，所述谷氨酰胺水溶液的体积分数为1％。7.一种扩增骨髓间充质干细胞的系统，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：周军年，裴雪涛，黄媛媛，岳文，周月环，
申请(专利权)人：华南生物医药研究院，中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44