一种可注射性抗菌肽水凝胶及其制备方法技术

本发明专利技术涉及抗菌水凝胶领域，特别是指一种可注射性抗菌肽水凝胶及其制备方法。解决了现有多肽水凝胶的特异性抗菌效果差、不能实现可注射、毒副作用大的问题。所述水凝胶经抗菌肽自组装制备而得。本发明专利技术以小分子抗菌肽为原料，抗菌肽能够破坏微生物膜，产生抗菌效果，因此不需要添加抗菌药物；以自组装机制制备水凝胶，不需要添加交联剂，且自组装能够在几分钟内完成。制备的水凝胶强度适中，且展现出剪切变稀效应，具有可注射性，能够适用于深层组织。制备的水凝胶具有较好的抗菌性能。

An injectable antimicrobial peptide hydrogel and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
一种可注射性抗菌肽水凝胶及其制备方法
本专利技术涉及抗菌水凝胶领域，特别是指一种可注射性抗菌肽水凝胶及其制备方法。
技术介绍
上世纪70年代，水凝胶抗菌敷料开始被欧美国家研制。相比于传统敷料，水凝胶敷料含水量较高，因此伤口不会结痂，愈合更快。水凝胶敷料主要成分是有机及高分子材料，因此在体内容易降解，易于排出。目前市面上的水凝胶敷料多是通过具有抗菌性的高分子或抗菌剂与高分子结合的技术制备，其抗菌性能主要来自于高分子基体或抗菌剂。抗菌肽是自然界中由生物有机体产生，用于抵抗细菌感染的活性分子。近年来，抗菌肽在伤口抗菌领域得到了广泛研究，文献表明抗菌肽具有广谱的抗菌活性和良好的生物相容性。随着检测技术以及蛋白质、多肽筛选技术的发展，越来越多抗菌肽的结构信息被科学家解析。研究表明抗菌肽通常具有典型的结构特征：1)富含疏水氨基酸，如Leu（亮氨酸）、IIe(异亮氨酸)、Val(缬氨酸)、Phe(苯丙氨酸)和Trp(色氨酸)等；2）包含大量的阳离子氨基酸，使多肽显正电性（+2—+9）；3）具有两亲性结构。分子自组装是分子利用分子间作用力（氢键作用、静电作用、疏水作用、超分子作用等）自行聚集、组织成规则结构的现象。多肽是由氨基酸按照一定的连接顺序，通过肽键结合而成，因此可以通过调节多肽中氨基酸种类和排列来调控自组装行为。专利CN201310517751.6，公开了一种包埋抗菌肽分子的医用水凝胶敷料及其制备方法，采用现有技术中化学合成或者采用基因工程的方法使用生物反应器将含有人源肽基因的载体在细胞中表达出人源肽，分离纯化可得；专利CN201811594955.9也公开了一种抗菌肽、抗菌肽水凝胶及其制备方法，主要应用于保持伤口局部湿润，保护新生肉芽组织不受损伤的外用药膜。水凝胶的应用不仅限于外用敷料，水凝胶有益的性能如果能实现可注射，则将带来更广大的应用前景。
技术实现思路
本专利技术提出一种可注射性抗菌肽水凝胶及其制备方法，解决了现有多肽水凝胶的特异性抗菌效果差、不能实现可注射、毒副作用大的问题。本专利技术的技术方案是这样实现的：一种可注射性抗菌肽水凝胶，所述水凝胶经抗菌肽自组装制备而得。所述抗菌肽序列为Ac-RKKWFW-NH2。所述的可注射性抗菌肽水凝胶的制备方法步骤如下：（1）抗菌肽的制备以Rinkamide-AM树脂为固相载体，按顺序加入氨基酸原料，以DMF为溶剂，在催化剂的作用下，利用固相合成技术，制备抗菌肽，纯化后得纯度≥95%的抗菌肽。（2）水凝胶的制备取步骤（1）制备的纯度≥95%的抗菌肽，加入蒸馏水超声溶解，制得抗菌肽水溶液，然后逐滴加入NaOH水溶液调pH，充分混合，直至形成水凝胶。所述步骤（1）中催化剂为1-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐和二异丙基乙胺的混合物。所述步骤（1）中氨基酸原料为以9-芴甲氧羰基保护的L型氨基酸。所述以9-芴甲氧羰基保护的L型氨基酸为Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH和Fmoc-Arg(Pbf)-OH。所述步骤（1）中固相载体的活性位点、氨基酸原料、1-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐、二异丙基乙胺的反应摩尔比为1：（1.5-3）：（1.5-3）：（1.5-3）：（6-11）。所述氨基酸原料的添加顺序为按照1:1:1:1:1:1的摩尔比依次加入Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH。所述步骤（2）中抗菌肽水溶液中抗菌肽的浓度为10-50mg/mL；NaOH水溶液的浓度为0.2-2mol/L。所述步骤（2）中pH为7-8。本专利技术的有益效果在于：（1）本专利技术以小分子抗菌肽为原料，抗菌肽能够通过正电荷与微生物膜发生静电作用，并通过两亲性结构与微生物膜的磷脂双分子层结合，改变微生物膜的通透性，产生抗菌效果，因此不需要添加抗菌药物；以自组装机制制备水凝胶，不需要添加交联剂，且自组装能够在几分钟内完成；（2）本申请制备的水凝胶强度适中，由于未进行化学交联，水凝胶只是通过分子间作用力形成，具有剪切变稀效应，能够在振荡作用下快速降低黏度，具有可注射性，能够适用于深层组织，使得制备的水凝胶具有较好的抗菌性能；（3）本申请本专利中多肽结构为一端疏水、一端亲水，具有典型的两亲性结构，易于依靠分子间疏水和π-π堆叠作用进行自组装。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为Ac-RKKWFW-NH2抗菌肽的分子结构。图2为抗菌肽水凝胶制备的工艺流程图。图3为抗菌肽水凝胶的振荡流变学测试；（A）是抗菌肽水凝胶的储存模量和损耗模量随频率的变化曲线，（B）是抗菌肽水凝胶的黏度随剪切速度的变化曲线。图4为抗菌肽水凝胶的抗菌性能评估实验图；（A）白色念珠菌，（B）金黄色葡萄球菌，（C）大肠杆菌。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1一种可注射性抗菌肽水凝胶的制备方法，工艺流程见图2，具体步骤如下：（1）抗菌肽的制备抗菌肽的序列为Ac-RKKWFW-NH2，包含3个疏水氨基酸和3个亲水氨基酸，符合抗菌肽的典型结构特征。Ac-RKKWFW-NH2抗菌肽以Rinkamide-AM树脂为固相载体，9-芴甲氧羰基保护的L型氨基酸：Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH为氨基酸原料，1-羟基苯并三氮唑（HOBt）、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、二异丙基乙胺（DIEA）为催化剂，DMF为溶剂，利用固相合成技术，按照多肽序列进行制备，其中，固相载体的活性位点、氨基酸原料、1-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐、二异丙基乙胺的反应摩尔比为1：1.5：1.5：1.5：6；氨基酸原料的添加顺序为按照1:1:1:1:1:1的摩尔比依次加入Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH。并通过高效液相色谱对其进行纯化，并对纯度进行检测，保证抗菌肽的纯度≥95%。（2）抗菌肽水凝胶的制备首先称取40mgAc-RKKWFW-NH2抗菌肽，加入1mL去离子水，超声充分溶解。此时Ac-RKKWFW-NH2抗菌肽水溶液的pH值为4左右。向溶液中缓慢滴加0.5MNaOH水溶液至形成水凝胶(pH=7.5)，制得抗菌肽水凝胶。实施例2一种可注射性抗菌肽水凝胶的制备方法，工艺流程见图2，具体步骤如下：（本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可注射性抗菌肽水凝胶，其特征在于：所述水凝胶经抗菌肽自组装制备而得。

【技术特征摘要】
1.一种可注射性抗菌肽水凝胶，其特征在于：所述水凝胶经抗菌肽自组装制备而得。2.根据权利要求1所述的可注射性抗菌肽水凝胶，其特征在于：所述抗菌肽序列为Ac-RKKWFW-NH2。3.权利要求1或2所述的可注射性抗菌肽水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）抗菌肽的制备以Rinkamide-AM树脂为固相载体，按顺序加入氨基酸原料，以DMF为溶剂，在催化剂的作用下，利用固相合成技术，制备抗菌肽，纯化后得纯度≥95%的抗菌肽；（2）水凝胶的制备取步骤（1）制备的纯度≥95%的抗菌肽，加入蒸馏水超声溶解，制得抗菌肽水溶液，然后逐滴加入NaOH水溶液调pH，充分混合，直至形成水凝胶。4.根据权利要求3所述的可注射性抗菌肽水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中催化剂为1-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐和二异丙基乙胺的混合物。5.根据权利要求3所述的可注射性抗菌肽水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中氨基酸原料为以9-芴甲氧羰基保护的L型氨基酸。6.根据权利要求5所述的可注射性抗菌肽水凝胶的制备方法，其特征在于：所述以9-芴甲氧羰基保护的L型氨基酸为F...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹凤仪，梅林，
申请(专利权)人：中原工学院，
类型：发明
国别省市：河南,41