一种胚状体培养基及其制备拐枣人工种子的方法技术

本发明专利技术公开了一种胚状体培养基，包括胚性细胞培养基和细胞胚培养基。通过胚性细胞培养基的制备和细胞胚培养基的制备可获得胚状体，从而获得人工种子，胚性细胞胚培养基和细胞胚培养基的配方简单，制备过程中操作容易，其成本低廉，得到的胚状体具有繁殖速度快和结构完整的特点。还公开了一种采用胚状体培养基制备拐枣人工种子的方法，包括胚状体的制备、人工胚乳的制备以及人工种皮的制备。解决了种子休眠时间长的问题，提高了种子发芽率，达到了快速育苗的目的。

A Embryo Culture Medium and Its Method for Preparing Artificial Seeds of Chinese Jujube

【技术实现步骤摘要】
一种胚状体培养基及其制备拐枣人工种子的方法
本专利技术涉及组织培养与林木植物快繁脱毒
，具体涉及一种胚状体培养基，还涉及一种采用胚状体培养基制备拐枣人工种子的方法。
技术介绍
植物试管苗技术即无菌组织培养技术，是在人为创造的无菌条件下将生活的离体器官(如根、茎、叶、茎段以及原生质体)、组织或细胞置于培养基内，并放在适宜的环境中，进行连续培养以获得细胞、组织或个体的技术。试管苗具有体积小，重量轻，生产不受季节限制，设备简单、成本低以及便于工厂化生产以及长途运输等优点。组织培养技术已经普遍应用于花卉、经济作物、林木的生产、保存、纯化、脱病毒以及快速繁殖及新品种选育等过程。人工种子是农业生产中使用的天然种子，一般都是由种皮、胚乳以及胚三部分构成。种皮通常在种子的外层起保护作用；胚乳含有大量的营养物质，是种苗萌发生长不可缺少的营养来源；胚由胚芽、胚轴、胚根以及子叶构成，将来发成植株。农业生物技术的发展，通过组织培养技术，可把植物组织的细胞培养成在形态及生理上与天然种子胚相似的胚状体，也叫作体细胞胚。这种体细胞胚有子叶、根以及茎分生组织的结构。科学家把体细胞胚包埋在胶囊内形成球状结构，使其具备种子机能。所以，人工种子是一种人工制造的代替天然种子的颗粒体，可以直接播种于田间。拐枣(HoveniaacerbaLindl)原产于黄河和长江流域，印度、尼泊尔、不丹以及缅甸北部等地也有分布，广泛栽培至中国华北、华东、中南、西北、西南以及华南各省。拐枣果柄具有丰富的食用价值，其种子也具有清热利尿、治风湿麻木等药用价值。国内拐枣研究最早于肖玲对拐枣果序梗发育的解剖学方面。此后，拐枣的研究主要侧重于优化果汁提取工艺、法以及提高果实加工产量等方面。在生产上，拐枣主要采用种子、扦插以及分檗等方法进行繁殖。李定康报道了拐枣种子沙藏的适宜时间为11月初至翌年清明。李英等对拐枣种子在适宜条件下进行萌发试验，测定拐枣种子30天的发芽率仅为4％，证明了种子具有休眠习性，同时发现将拐枣种子低温层积75天，其发芽率达到72％，而在低温层积90天后，拐枣种子的发芽率能达到76％。由此可见，拐枣种子休眠期长，难以达到生产上所要求的快速育苗。本研究旨在通过人工种子的制备方法解决拐枣种子的休眠的问题，通过组织培养的方法可以获得数量很多的胚状体，而且繁殖速度快，结构完整，人工种子比采用试管苗的繁殖方法更能降低成本，而且方便机械化播种，可节省劳动力，生产人工种子不受季节限制。制作拐枣的人工种子的方法主要在于将拐枣的胚状体制作出来，体细胞胚是制作人工种子的起始材料。它既可由外植体的表皮细胞直接产生，也可由愈伤组织的表层细胞产生。先通过外植体消毒灭菌，将外植体移植到培养基内，获得无菌苗，然后使用组织培养基和无菌苗茎段诱导愈伤组织，使用获得的愈伤组织诱导培养胚性细胞，再使用胚性细胞诱导体细胞胚即获得原材料。科学工作者们花费巨大的劳动，进行大量的筛选才能获得体细胞胚、人工胚乳是包埋体细胞胚的胶状介质。美国的一个研究组花了近两年时间，从百余种材料中筛选到广泛使用的人工种子包埋介质海藻酸钠。这种物质在0.1M氯化钙溶液中可以迅速固化成透明的小胶球。海藻酸钠价格低廉，质地柔软无毒性，还可人为地在其中加入各种营养物质和生长调节剂，因此是一种迄今为止已发现的比较理想的体细胞胚包埋剂。但这种物质作人工胚乳还存在一些缺点，如营养物质易泄漏，保水性差，而且胶球很易粘连等。为此，科学家又设想在胶球外包一层薄膜——人工种皮。我们的专利技术正是结合这些科学家的经验以及我们的研究探索解决现在拐枣存在的问题。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的是根据拐枣人工种子的建立过程和特点，提供一种胚状体培养基，具有成本低廉和提高拐枣的发芽率的特点。为了达到上述技术目的，本专利技术的技术方案是：一种胚状体培养基，包括胚性细胞培养基和细胞胚培养基。胚性细胞培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS(一种培养基的代号，以下简称MS)、玉米素0.1-1.0mg/L、α-萘乙酸0.08-0.3mg/L、活性炭0.5-2g/L、蔗糖10-30g/L、琼脂粉2-10g/L以及纯净水补足余量。细胞胚培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、苄氨基嘌呤0.4-1.0mg/L、激动素0.2-1.0mg/L、活性炭0.5-2g/L、蔗糖10-50g/L、琼脂粉2-10g/L以及纯净水补足余量。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：通过胚性细胞培养基和细胞胚培养基的组分可获得胚状体，从而获得人工种子。细胞胚培养基和细胞胚培养基的配方简单，制备过程中操作容易，得到的胚状体具有繁殖速度快和结构完整的特点。进一步优选为：胚性细胞培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、玉米素0.4-0.6mg/L、α-萘乙酸0.08-0.3mg/L、活性炭0.5-1g/L、蔗糖15-25g/L、琼脂粉4-6g/L以及纯净水补足余量。细胞胚培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、苄氨基嘌呤0.1-2.0mg/L、激动素0.4-0.6mg/L、活性炭0.5-1g/L、蔗糖10-30g/L、琼脂粉4-6g/L以及纯净水补足余量。采用上述技术方案，提供了胚性细胞培养基和细胞胚培养基的更优选的配方，实现了胚状体的制备。进一步优选为：1/2MS配方为：大量元素：硝酸铵NH4NO3825mg/L、硝酸钾KNO3950mg/L、二水氯化钙氯化钙·2H2O220mg/L、七水硫酸镁MgSO4·7H2O185mg/L以及磷酸二氢钾KH2PO485mg/L。微量元素：碘化钾KI0.415mg/L、硼酸H3BO33.1mg/L、四水硫酸锰MnSO4·4H2O11.15mg/L、七水硫酸锌ZnSO4·7H2O4.3mg/L、二水钼酸钠Na2MoO4·2H2O0.125mg/L、五水硫酸铜CuSO4·5H2O0.0125mg/L以及六水氯化钴CoCl2·6H2O0.0125mg/L。铁盐：七水硫酸亚铁FeSO4·7H2O27.8mg/L和二水乙二胺四乙酸二钠Na2-EDTA·2H2O37.3mg/L。有机物质：肌醇100mg/L、烟酸VB5或VPP0.5mg/L、盐酸吡哆醇VB60.5mg/L、盐酸硫胺素VB10.1mg/L以及甘氨酸2.0mg/L。蔗糖30g/L。琼脂7g/L。采用上述技术方案，1/2MS中无机盐的种类和离子浓度较多，溶液中离子比较平衡，稳定性强，有利于胚性细胞培养基和细胞胚培养基的制备。本专利技术还提供了一种采用胚状体培养基制备拐枣人工种子的方法，具体的技术方案是：一种采用胚状体培养基制备拐枣人工种子的方法，包括胚状体的制备、人工胚乳的制备以及人工种皮的制备，包括如下步骤：胚性细胞培养基的制备：称量琼脂粉加入装有纯净水的锅中煮沸。取0.1升10倍1/2MS母液与玉米素、α-萘乙酸以及活性炭溶解后加入锅中。称量蔗糖加入锅中并让其溶解，纯净水定容到1.0升。用盐酸和氢氧化钠调节pH在5.8-6.0。分装后，进行高温高压灭菌20分钟。冷却成固体，接愈伤组织进行无菌培养。细胞胚培养基的制备：称量琼脂粉加入装有纯净水的锅中煮沸。取0.1升10倍1/2MS母液与苄氨基嘌呤、激动素以及活性炭溶解后加入锅中。称量蔗糖加入锅中并让其溶解，纯净水定容本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胚状体培养基，包括胚性细胞培养基和细胞胚培养基；其特征在于：所述胚性细胞培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、玉米素0.1‑1.0mg/L、α‑萘乙酸0.08‑0.3mg/L、活性炭0.5‑2g/L、蔗糖10‑30g/L、琼脂粉2‑10g/L以及纯净水补足余量；所述细胞胚培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、苄氨基嘌呤0.4‑1.0mg/L、激动素0.2‑1.0mg/L、活性炭0.5‑2g/L、蔗糖10‑50g/L、琼脂粉2‑10g/L以及纯净水补足余量。

【技术特征摘要】
1.一种胚状体培养基，包括胚性细胞培养基和细胞胚培养基；其特征在于：所述胚性细胞培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、玉米素0.1-1.0mg/L、α-萘乙酸0.08-0.3mg/L、活性炭0.5-2g/L、蔗糖10-30g/L、琼脂粉2-10g/L以及纯净水补足余量；所述细胞胚培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、苄氨基嘌呤0.4-1.0mg/L、激动素0.2-1.0mg/L、活性炭0.5-2g/L、蔗糖10-50g/L、琼脂粉2-10g/L以及纯净水补足余量。2.根据权利要求1所述的胚状体培养基，其特征在于：所述胚性细胞培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、玉米素0.4-0.6mg/L、α-萘乙酸0.08-0.3mg/L、活性炭0.5-1g/L、蔗糖15-25g/L、琼脂粉4-6g/L以及纯净水补足余量；所述细胞胚培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、苄氨基嘌呤0.1-2.0mg/L、激动素0.4-0.6mg/L、活性炭0.5-1g/L、蔗糖10-30g/L、琼脂粉4-6g/L以及纯净水补足余量。3.根据权利要求1所述的胚状体培养基，其特征在于：所述1/2MS配方为：大量元素：硝酸铵NH4NO3825mg/L、硝酸钾KNO3950mg/L、二水氯化钙CaCl2·2H2O220mg/L、七水硫酸镁MgSO4·7H2O185mg/L以及磷酸二氢钾KH2PO485mg/L；微量元素：碘化钾KI0.415mg/L、硼酸H3BO33.1mg/L、四水硫酸锰MnSO4·4H2O11.15mg/L、七水硫酸锌ZnSO4·7H2O4.3mg/L、二水钼酸钠Na2MoO4·2H2O0.125mg/L、五水硫酸铜CuSO4·5H2O0.0125mg/L以及六水氯化钴CoCl2·6H2O0.0125mg/L；铁盐：七水硫酸亚铁FeSO4·7H2O27.8mg/L和二水乙二胺四乙酸二钠Na2-EDTA·2H2O37.3mg/L；有机物质：肌醇100mg/L、烟酸VB5或VPP0.5mg/L、盐酸吡哆...

【专利技术属性】
技术研发人员：王小帆，史玮，陈思思，
申请(专利权)人：西安同人五凤农业有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西,61