包含rhAnnexin V-128的冻干组合物、它们的制备方法及其用于制备含有技术

描述了包含冻干的rhAnnexin V‑128的组合物，其适于制备用于静脉内施用的

Freeze-dried compositions containing rhAnnexin V-128, their preparation methods and their use in preparing the containing compounds

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含rhAnnexinV-128的冻干组合物、它们的制备方法及其用于制备含有99mTc-rhAnnexinV-128的制剂的用途
本专利技术涉及标记的化合物，尤其涉及锝标记的重组蛋白AnnexinV-128。
技术介绍
rhAnnexin-V-128是已知的重组蛋白，其序列为(SEQIDNO:1):JinM.等在"EssentialRoleofB-helixCalciumBindingSitesinAnnexinV-MembraneBinding"TheJournalofBiologicalChemistry-Vol.279-No.39-pp.40351-40357(2004)中描述了该重组蛋白，其是天然存在的人血清蛋白AnnexinV的突变体形式，其中在rhAnnexinV(是指野生型人AnnexinV)的N末端添加了6个氨基酸(Ala-Gly-Gly-Cys-Gly-His)以形成内源99mTc结合位点。此外，第316位的半胱氨酸已经突变为丝氨酸(参见上文序列中带下划线的S)；具有该突变，rhAnnexinV-128序列中剩余的唯一半胱氨酸是位于N末端99mTc结合位点中的第4位的半胱氨酸。rhAnnexinV-128通过已知的重组技术在大肠杆菌中产生(参见例如JinM.等"EssentialRoleofB-helixCalciumBindingSitesinAnnexinV-MembraneBinding"TheJournalofBiologicalChemistry-Vol.279-No.39-pp.40351-40357(2004))，并以冷冻形式储存。如上所述，在N末端引入的修饰允许该蛋白结合99mTc以形成相应的标记蛋白，借助于其作用机制，所述标记蛋白作为诊断工具以及用于监测治疗效率具有广泛的潜在应用，并且所述标记蛋白通常通过静脉内施用来使用。最有趣的适应症是在风湿病学、心血管疾病、肿瘤学、移植物排斥，自身免疫疾病、神经病学领域，但是对细胞凋亡过程作为标志的其他病理也有空间。关于心血管疾病，特别是主动脉瘤，可以考虑化疗心脏毒性和动脉粥样硬化。还考虑其他适应症，例如移植物排斥、自身免疫疾病(除了类风湿性关节炎，例如炎性肠病......)或神经退行性疾病。然而，由于各种问题，99mTc-rhAnnexinV-128的制备相当复杂。由于在两个半胱氨酸之间形成二硫键，rhAnnexinV-128中存在的半胱氨酸容易导致二聚化，从而降低制剂的化学纯度。此外，蛋白质经历蛋白质聚集，这是错误折叠的蛋白质聚集的物理现象。应该注意的是，rhAnnexinV-128经历几个压力过程步骤(冻融、大量配制、冻干)，以及用放射性99mTcO4-溶液长期储存和重构，在此期间可能发生聚集。由于这些原因，化学纯度是在该制备中必须仔细监测的一个分析参数。放射化学纯度也是放射性药物的关键参数。出于安全原因以及技术/诊断性能两者，这一点至关重要。用99mTcO4-标记通过涉及REDOX反应和反式螯合的一系列反应/平衡发生，并且如果条件不是最佳，可能形成若干放射化学杂质。因此，重组蛋白rhAnnexinV-128是敏感的，在冻融期间可以絮凝，可以在解冻过程、制造过程期间以及放射性标记期间通过Cys的游离SH基团二聚化。需要特定的配制来产生合适的条件，从而产生具有高放射化学和化学纯度以及高稳定性的最终99mTc-rhAnnexinV-128制剂。Tait等在"StructuralRequirementsforInVivoDetectionofCellDeathwith99mTc-AnnexinV"；TheJournalofNuclearMedicine-Vol.46-No.5-pp.807-815(2005)中描述了用99mTc标记rhAnnexinV-128蛋白。然而，Tait的工作描述了两个小瓶试剂盒方法(以溶液形式的rhAnnexinV-128)，需要最终纯化以获得99mTc-rhAnnexinV-128。这不是最佳配制，因为最终纯化是常规临床实践中的重要缺点，因为它需要相当复杂的产品操作，具有相关的放射安全性和无菌性问题并且与药物质量标准不相容。专利申请CN103159842和LuC.等"Kitformulationfor99mTc-labelingofrecombinantAnnexinVmoleculewithaC-terminallyengineeredcysteine"；JRadioanalNuclChem-Vol.304-pp.571-578(2015)描述了用于标记在C-末端修饰的不同形式的AnenxinV的制备方法。所述方法主要包括两个步骤：1)制备含有蛋白质、葡庚糖酸盐和作为过渡配体的EDTA、亚锡盐和稀盐酸的磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)；2)在步骤1的溶液中添加99mTcO4Na，并在35-37℃下将所得溶液在水中混合，得到标记产物99mTc-Cys-AnnexinV。然而，根据CN103159842的AnnexinV与本专利技术的AnnexinV-128不同，因为它在C-末端呈现能够结合Tc-99m的单个半胱氨酸残基，同时缺乏修饰的N-末端，其中添加了六个氨基酸(其中有一个Cys)；此外，在AnnexinV-128中，在第316位存在的Cys已经被丝氨酸取代，因此减去了一个通过二硫键有利于二聚化的残基。上述专利和文章中描述的方法在pH＝7.4下进行，因此它不能应用于涉及AnnexinV-128的方法，因为该pH有利于二聚体形成。上述专利和论文中描述的方法在pH＝7.4下进行，因此它不能应用于涉及AnnexinV-128的方法，因为该pH有利于二聚体形成。此外，在上述专利申请CN103159842和Lu等的出版物中，没有提及化学纯度的任何表征和用于防止二聚化的任何抗氧化剂，相反，这对于根据本专利技术的AnenxinV-128是关键的。如上面所述，显然需要开发包含AnnexinV-128的新组合物，其允许更容易的标记过程并且导致最终的99mTc标记的rhAnnexinV-128制剂具有高化学纯度和放射化学纯度和高稳定性。该标记过程应基于预先配制的单瓶的直接重构，可能在注射前不需要任何额外的过滤或纯化步骤。附图说明图1报告了制备根据本专利技术的冻干的rhAnnexinV-128的方法的示意图。图2显示在健康小鼠(a)和胶原蛋白诱导的关节炎小鼠模型(b)的前爪中的99mTc-rhAnnexinV-128摄取的SPECT图像。图3c显示用抗炎药物处理后CIA小鼠的摄取(不再检测到99mTc-rhAnnexinV-128摄取)。专利技术简述描述了包含冻干的rhAnnexinV-128的组合物，其适于制备用于静脉内施用的99m锝制剂。专利技术详述借助于适于静脉内施用的冻干组合物，本专利技术允许克服上述问题，所述冻干组合物在5.0-6.6的pH范围内包含AnnexinV-128和合适的赋形剂，特别是包括抗氧化剂。此外，本申请还涉及通过在上述组合物中加入来自商业99mTc04-发生器的合适体积的洗脱液而获得的制剂。优选地，如上定义的冻干组合物还包括特定缓冲剂。包括抗氧化剂的目的是在冻干组合物的长期储存期间以及在标记后的99mTc本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.适于静脉内施用的冻干组合物，其在5.0‑6.6的pH范围内包含rhAnnexin V‑128和抗氧化剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.11 IT 1020160001018751.适于静脉内施用的冻干组合物，其在5.0-6.6的pH范围内包含rhAnnexinV-128和抗氧化剂。2.根据权利要求1所述的冻干组合物，其中所述抗氧化剂选自：偏亚硫酸氢钠、烟酰胺、盐酸吡哆醇、α-生育酚乙酸酯、硫代甘油。3.根据权利要求1和2所述的冻干组合物，还包含选自乳酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙醇酸盐缓冲液、TRIS和组氨酸缓冲液的缓冲液。4.根据权利要求1-3所述的冻干组合物，适于静脉内施用，其包含：-抗氧化剂；-pH为5.0-6.6的缓冲液；-还原剂；-反式螯合剂；-冻干保护剂和成饼剂；和可能的放射稳定性增强剂和/或增溶剂。5.根据权利要求4所述的冻干组合物，其中所述组分以以下含量存在：-抗氧化剂的含量大于0.005mg/瓶；-pH为5.0-6.6的缓冲液的浓度大于10mM；-还原剂的含量大于0.005mg/瓶；-反式螯合剂的含量大于0.02mg/瓶；-冻干保护剂和成饼剂的含量大于10mg/瓶；如果存在放射稳定性增强剂和/或增溶剂，其含量分别大于0.005mg/瓶和大于1mg/瓶。6.用于制备根据前述权利要求之一的单瓶冻干制剂的方法，包括以下步骤：-将冷冻的rhAnnexinV-128解冻；-添加抗氧化剂/还原剂；-通过切向流过滤交换缓冲液，用选自乳酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙醇酸盐缓冲液、TRIS和组氨酸缓冲液的缓冲液替代提供r...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·富加扎，M·F·马立亚尼，F·奥兰迪，D·基科，D·巴尔巴托，
申请(专利权)人：国际先进加速器应用公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH