检测抗环瓜氨酸肽抗体的均相免疫检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种用于检测抗环瓜氨酸肽抗体的均相免疫检测试剂盒。该试剂盒基于双抗原夹心反应模式，采用高灵敏度和特异性的环瓜氨酸肽偶联载体蛋白作为抗原原料制成，其不仅能够检测出所有类型的抗瓜氨酸抗体，而且具有特异性强、信号放大效果好、灵敏度高、线性范围宽、操作简单、稳定性好和精密度高的优点。

Homogeneous Immunoassay Kit for Detecting Anti-Cyclic Citrullinated Peptide Antibody and Its Application

【技术实现步骤摘要】
检测抗环瓜氨酸肽抗体的均相免疫检测试剂盒及其应用
本专利技术属于免疫分析
，具体涉及一种用于检测抗环瓜氨酸肽抗体均相免疫检测试剂盒及其制备方法和使用方法。
技术介绍
抗环瓜氨酸肽(Anticycliccitrullinatedpeptideantibodies，抗CCP)抗体是一种新型的血清标志物，临床检验实践表明，抗CCP抗体的滴度通常和疾病的活动度相关，70-80％患者在疾病很早期就在血清和滑膜液中检测出抗CCP抗体，此抗体具有高度的特异性和一定的预后价值。目前研究用或商品化抗瓜氨酸抗体试剂盒均采用间接法检测，尤其是采用ELISA间接法检测。人体内抗瓜氨酸抗体类型既有IgG，还有IgA、IgM，使用传统间接法反应模式只能检测IgG类型的抗体。而采用ELISA间接法检测模式，不仅只能检测IgG类型的抗体，而且灵敏度较低，特异性也较差，操作也较为繁琐。因此，目前亟需研究开发一种灵敏度高、特异性好、操作方法简便，且能够检测所有类型抗体的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种用于检测抗环瓜氨酸肽抗体的均相免疫检测试剂盒。该试剂盒不仅能够检测出所有类型的抗瓜氨酸抗体，而且具有特异性强、信号放大效果好、灵敏度高、线性范围宽、操作简单、稳定性好和精密度高的优点。为此，本专利技术第一方面提供了一种制备用于检测抗环瓜氨酸肽抗体的均相免疫检测试剂盒的方法，其包括：制备第一组合物，所述第一组合物包含组分a，所述组分a由能够与单线态氧反应生成可检测信号的受体以及与之结合的第一抗原构成，其中所述第一抗原能够与抗环瓜氨酸肽抗体的抗原表位第一识别位点特异性结合；制备第二组合物，所述第二组合物包含组分b，所述组分b由能够与抗环瓜氨酸肽抗体的抗原表位第二识别位点特异性结合的第二抗原以及与之结合的特异性配对物中的一个成员构成；制备第三组合物，所述第三组合物包含组分c，所述组分c由能够在激发状态产生单线态氧的供体以及与之结合的特异性配对物中的另一个成员构成。本专利技术中，所述第一抗原和所述第二抗原相同或不同，二者独立地选自合成的含瓜氨酸的环型肽、含瓜氨酸的线型肽、由至少2个单一含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽、含有至少2个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物和瓜氨酸化蛋白。在本专利技术的一些优选的实施例中，第一抗原和所述第二抗原分别独立地选自合成的含环瓜氨酸的环形肽、含瓜氨酸的线型肽、由至少2个单一含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽和含有至少2个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物。在本专利技术的一些进一步优选的实施例中，所述第一抗原和所述第二抗原分别独立地为由2-4个含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽或含有2-4个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物；优选所述含瓜氨酸的肽段选自SEQIDNo.1-4。在本专利技术的一些具体优选的实施例中，所述第一抗原通过中间体与受体相结合，所述中间体为亲水性高分子物质。在本专利技术的一些实施例中，所述中间体为蛋白质，优选选自血蓝蛋白、卵清蛋白、牛血清白蛋白或牛甲状腺球蛋白。在本专利技术的另一些实施例中，所述中间体选自树枝状大分子、聚羧酸酯、聚巯基和聚乙二醇。在本专利技术的一些优选的实施例中，所述第二抗原与生物素结合，而所述供体与链霉亲和素结合。在本专利技术的一些实施例中，所述组分a在第一组合物中的总浓度为10-200μg/mL，优选20-150μg/mL，更优选25-100μg/mL。在本专利技术的一些实施例中，所述组分b在第二组合物中的浓度为0.1-10μg/mL，优选0.5-5μg/mL，更优选1-3μg/mL。本专利技术中，所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述受体为填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒。本专利技术中，所述供体为光活化的或化学活化的敏化剂，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述供体为填充有感光化合物的高分子微粒，在光激发下能够产生单线态氧。本专利技术第二方面提供了一种如本专利技术第一方面所述的方法制备得到的用于检测抗环瓜氨酸肽抗体的均相免疫检测试剂盒。本专利技术第三方面提供了一种检测待测样本中抗环瓜氨酸肽抗体的均相免疫检测方法，其包括使用如本专利技术第二方面所述的均相免疫检测试剂盒来检测待测样本中是否存在抗环瓜氨酸肽抗体和/或确定抗环瓜氨酸肽抗体的含量。根据本专利技术，该方法包括：步骤R1，将待测样本与第一组合物和第二组合物混合后反应得到第一混合物；步骤R2，将第一混合物与第三组合物混合后反应得到第二混合物；步骤R3，使能量或者活性化合物与所述第二混合物接触，激发所述供体产生单线态氧，所述受体能够与接收到的单线态氧反应生成可检测的化学发光信号；步骤R4，检测步骤R3中所述化学发光信号的存在和/或强度，从而判断测待测样品中是否存在抗环瓜氨酸肽抗体和/或确定抗环瓜氨酸肽抗体的含量。根据本专利技术的一些实施方式，所述方法还包括在步骤R1之前的制作抗环瓜氨酸肽抗体标准工作曲线的步骤。在本专利技术的一些具体实施例中，在步骤R4中，检测步骤R3中所述化学发光信号的强度，并基于所述抗环瓜氨酸肽抗体标准工作曲线来确定待测样品中抗环瓜氨酸肽抗体的含量。在本专利技术的一些优选的实施例中，利用600-700nm波长的激发光照射第二混合物，激发供体产生单线态氧，受体与接触到的单线态氧反应生成520-620nm的发射光，检测发射光的信号强度，从而判断待测样品中是否存在抗环瓜氨酸肽抗体和/或确定抗环瓜氨酸肽抗体的含量。本专利技术第四方面提供了一种如本专利技术第二方面所述的均相免疫检测试剂盒或如本专利技术第三方面所述的方法在检测待测样本中抗环瓜氨酸肽抗体的存在和/或含量中的应用，其中，所述待测样本选自血液、血液衍生物、血清、血浆、尿液、脑脊髓液、唾液、滑液和肺气肿积液。本专利技术第五方面提供了一种如本专利技术第一方面所述的方法在制备用于检测怀疑患有类风湿性关节炎的受治疗者的待测样品中的抗环瓜氨酸肽抗体，由此确定所述待测样品中抗环瓜氨酸肽抗体的水平，并将因此确定的水平与受治疗者的类风湿性关节炎的存在、风险、潜在性或倾向性相关联的试剂盒中的应用。本专利技术的有益效果如下：1)该试剂盒所采用的检测技术为一种均相反应体系，相较于现有的非均相反应体系检测方法，存在着免清洗、高通量、包被/标记工艺对抗原抗体的活性无影响、特异性高、灵敏度好、线性范围宽、背景干扰小、反应速度快、操作简便、技术要求不高等优点，并可实现全自动化高通量测试。2)本专利技术提供的检测抗环瓜氨酸肽抗体的均相免疫检测试剂盒，采用高灵敏度和特异性的环瓜氨酸肽作为抗原原料，具备以下性能优点：信号值范围宽，达到定量测试标准；灵敏度高，对早期RA(Rheumatoidarthritis，类风湿性关节炎)与确定RA患者的敏感度高；稳定性好，精密度好。附图说明为使本专利技术容易理解，下面结合附图来说明本专利技术。图1显示了序列为SEQIDNo.1的单独肽段与RA组阳性反应结果。图2显示了串联肽段与RA组阳性反应结果。图3显示了抗原偶联BSA蛋白产物的电泳检测结果。图4显示了抗原偶联BSA蛋白产物与RA组阳性反应结果。具体实施方式为使本专利技术容易理解，下面将详细说明本专利技术。但在详细描述本专利技术前，应当理解本专利技术不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备用于检测抗环瓜氨酸肽抗体的均相免疫检测试剂盒的方法，其包括：制备第一组合物，所述第一组合物包含组分a，所述组分a由能够与单线态氧反应生成可检测信号的受体以及与之结合的第一抗原构成，其中所述第一抗原能够与抗环瓜氨酸肽抗体的抗原表位第一识别位点特异性结合；制备第二组合物，所述第二组合物包含组分b，所述组分b由能够与抗环瓜氨酸肽抗体的抗原表位第二识别位点特异性结合的第二抗原以及与之结合的特异性配对物中的一个成员构成；制备第三组合物，所述第三组合物包含组分c，所述组分c由能够在激发状态产生单线态氧的供体以及与之结合的特异性配对物中的另一个成员构成。

【技术特征摘要】
1.一种制备用于检测抗环瓜氨酸肽抗体的均相免疫检测试剂盒的方法，其包括：制备第一组合物，所述第一组合物包含组分a，所述组分a由能够与单线态氧反应生成可检测信号的受体以及与之结合的第一抗原构成，其中所述第一抗原能够与抗环瓜氨酸肽抗体的抗原表位第一识别位点特异性结合；制备第二组合物，所述第二组合物包含组分b，所述组分b由能够与抗环瓜氨酸肽抗体的抗原表位第二识别位点特异性结合的第二抗原以及与之结合的特异性配对物中的一个成员构成；制备第三组合物，所述第三组合物包含组分c，所述组分c由能够在激发状态产生单线态氧的供体以及与之结合的特异性配对物中的另一个成员构成。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一抗原和所述第二抗原相同或不同，二者独立地选自合成的含瓜氨酸的环型肽、含瓜氨酸的线型肽、由至少2个单一含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽、含有至少2个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物和瓜氨酸化蛋白。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一抗原和所述第二抗原分别独立地选自合成的含环瓜氨酸的环形肽、含瓜氨酸的线型肽、由至少2个单一含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽和含有至少2个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一抗原和所述第二抗原分别独立地为由2-4个含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽或含有2-4个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物；优选所述含瓜氨酸的肽段选自SEQIDNo.1-4。5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其特征在于，所述第一抗原通过中间体与受体相结合，所述中间体为亲水性高分子物质。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述中间体为蛋白质，优选选自血蓝蛋白、卵清蛋白、牛血清白蛋白或牛甲状腺球蛋白。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述中间体选自树枝状大分子、聚羧酸酯、聚巯基和聚乙二醇。8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其特征在于，所述第二抗原与生物素结合，而所述供体与链霉亲和素结合。9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其特征在于，所述组分a在第一组合物中的总浓度为10-200μg/mL，优选20-150μg/mL，更优选25-100μg/mL；和/或，所述组分b在第二组合物中的浓度为0.1-10μg/mL，优选0.5-5μg/mL，更优选1-3μg/mL。10.根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，其特征在于，所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物，其为非粒子形...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶星，廖智星，刘宇卉，李临，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：北京科美生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11