使不产毒微藻产生微囊藻毒素的方法及得到的产毒微藻技术

本发明专利技术涉及一种使不产毒微藻产生微囊藻毒素的方法；还涉及通过该方法得到的可产生微囊藻毒素的微藻。本发明专利技术首次提供了使不产毒微藻产生微囊藻毒素的方法以及得到的产毒藻株，这是本领域首次利用不产毒微藻改造成产微囊藻毒素微藻的报道。我们首次实现了使用生物合成的方法，从无机物开始合成微囊藻毒素。尽管得到的藻株产生的微囊藻毒素含量很低，但是，从无到有已经是飞跃，并且我们可以以该藻株为基础，进行后续研究，以提高微囊藻毒素产量。

The method of producing microcystins from non-toxic microalgae and the obtained toxic microalgae

【技术实现步骤摘要】
使不产毒微藻产生微囊藻毒素的方法及得到的产毒微藻
本专利技术涉及微藻分子生物学领域，更特别地，涉及涉及一种不产毒微藻产生微囊藻毒素的方法；还涉及通过该方法得到的可产生微囊藻毒素的微藻。
技术介绍
微囊藻是水华蓝藻中最广、产量最大并且危害最严重的种类。微囊藻衰老、死亡或溶解后会释放出大量的藻毒素，不仅危及水体生态，还危及人类饮用水安全。微囊藻毒素是一种环状七肽化合物，已有研究显示，微囊藻毒素可以在肝细胞中富集，引起肝损伤，严重可引起肝癌。因此，对微囊藻毒素的研究具有生态学意义和医学意义。已有研究从微囊藻基因组中鉴定出一个与藻毒素合成有关的基因簇。然而，现有的用于研究的微囊藻毒素均提取自产毒微囊藻。尽管有研究者尝试将该基因簇导入不产毒的基因，但没有报道获得以不产毒的微藻为基础得到的转基因产毒微藻。原因可能是多方面的，首先，该基因簇包含10个基因，长度达到50-60kb，要将这么巨大的DNA导入其他微藻得到突变株，并使上面的基因得以表达，是一个非常困难的事情。其次，即便得到了能够表达基因簇上的突变株，微藻细胞内的环境中未必有合成藻毒素必需的其他物质。因此，构建能表达微囊藻毒素的微藻突变株，既需要找到特定的藻株，具有合成微囊藻毒素的必需底物和其他物质；同时，还需要构建出使微囊藻毒素合成相关的基因簇能够在该藻株内表达的方法。
技术实现思路
为解决以上问题，本专利技术提供了一种使不产毒微藻产生微囊藻毒素的方法，其包括在所述不产毒微藻中表达mcy基因簇中各基因的步骤。在一个具体实施方案中，所述mcy基因簇的序列获取号为GenBank:AF183408.1。在一个具体实施方案中，所述不产毒微藻为聚球藻。在一个具体实施方案中，所述方法包括以下步骤：S1：向所述聚球藻中转入所述mcy基因簇中各基因的表达框，得到mcy聚球藻；S2：培养所述mcy聚球藻，收获mcy聚球藻藻细胞；S3：从所述mcy聚球藻藻细胞中提取微囊藻毒素。在一个具体实施方案中，S1中所述mcy基因簇中各基因的表达框通过质粒载体转入所述聚球藻中。在一个具体实施方案中，S1包括以下步骤：S11：将所述mcy基因簇中各基因的表达框插入质粒载体中，得到mcy基因表达载体；S12：将mcy基因表达载体转入所述聚球藻中。在一个具体实施方案中，所述mcy基因簇中各基因的表达框共同构成两个操纵子。在一个具体实施方案中，所述两个操纵子分别通过两个psbA2启动子驱动表达。在一个具体实施方案中，所述两个psbA2启动子的背对背设置。在一个具体实施方案中，所述两个psbA2启动子之间设置有Ω片段。在一个具体实施方案中，所述psbA2启动子的序列如SEQIDNO:1所示。在一个具体实施方案中，S11中，所述质粒载体是插入了可使所述质粒载体在聚球藻PCC7942中复制的复制起始位点的pGF质粒。在一个具体实施方案中，所述复制起始位点的序列如SEQIDNO:2所示。在一个具体实施方案中，所述聚球藻为聚球藻PCC7942。本专利技术还提供了上述方法得到的可产生微囊藻毒素的微藻。本专利技术提供了使不产毒微藻产生微囊藻毒素的方法，还提供了通过该方法得到的产生微囊藻毒素的微藻，这是本领域首次利用不产毒微藻改造成产微囊藻毒素微藻的报道。我们首次实现了使用生物合成的方法，从无机物开始合成微囊藻毒素。尽管得到的藻株产生的微囊藻毒素含量很低，但是，从无到有已经是飞跃，并且我们可以以该藻株为基础，进行后续研究，以提高微囊藻毒素产量。附图说明图1为双向启动子的结构示意图；图2为pGF质粒的图谱；图3为pGF质粒转化聚球藻PCC7942的转化产物涂布筛选平板培养后的平板照片，可见到，平板上没有转化子长出；图4为GenBank中的mcy基因簇的结构示意图；图5为重构组装mcy基因簇的流程图；图6为两端分别带有mcyA和mcyD的5’端的双向启动子的示意图；图7为构建的表达载体mcy-pGF-ori的质粒图谱；图8转化子中mcy基因簇的各基因的表达情况；图9为mcy7942和野生型7942在BG11中的生长曲线的对比；图10为mcy7942的液质联用分析图谱。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。1.双向启动子的构建首先，我们对myc基因簇中本身的双向启动子是否能够在聚球藻PCC7942中启动转录进行验证。这个双向启动子的3’和5’端分别加上GFP基因，然后连在7942的中性平台上，最后在显微镜下观察是否有GFP荧光。结果显示，不管是在3’还是在5’端加上GFP基因，都没有GFP荧光产生，因此我们判断这个双向启动子在聚球藻PCC7942中不能发挥作用。为了在聚球藻PCC7942中表达藻毒素合成相关的基因簇，我们通过多次验证鉴定了一个可在聚球藻PCC7942中表达的强启动子psbA2(SEQIDNO:1)，并以该启动子为基础，构建双向启动子。如图1所示，以Ω片段(通过DraI酶切pRL57得到的约2kb的片段)为桥将两个psbA2启动子背对背连接起来，即，中间是Ω片段，两边分别连接一个psbA2(SEQIDNO:1)，并且两个psbA2的方向均背向Ω。该结构在一个片段上串有两个背向的psbA2启动子，使它们可以在一个质粒上启动各自的操纵子转录，另一方面，Ω片段可消除其两侧片段三级结构的相互影响，并且还能提供对壮观霉素的抗性作为筛选标记。双向启动子的构建过程在本实验中通过融合PCR的方法完成，但是，本专利技术的技术方案不限于此，本领域技术人员也可通过酶切连接或其他构建方式来完成。2.表达质粒载体的改造pGF质粒载体是一种酵母-细菌穿梭质粒，一般用来构建在酵母中进行蛋白表达的表达质粒，其结构如图2所示。然而，我们通过预实验发现，将pGF转入聚球藻PCC7942中用相应的抗性筛选得不到阳性克隆(图3)。这说明，pGF在聚球藻PCC7942中无法复制。为了克服这个问题，我们鉴定了一段复制起始序列(SEQIDNO:2)，将其加在pGF载体的BamHI位点处，得到pGF-ori质粒载体，经检测，pGF-ori可在聚球藻PCC7942中复制。将改造后的质粒pGF-ori与前文构建的双向启动子结合，可得到能够在大肠杆菌中构建克隆，并在聚球藻PCC7942中表达基因的质粒。3.mcy基因簇合成mcy基因簇序列来自GenBank，获取号AF183408.1，涉及10个基因，mcyA、B、C是非核糖体肽合成酶；mcyD是I型多聚乙酰合成酶；mcyG和E都具有非核糖体肽合成酶的结构域和I型多聚乙酰合成酶结构域；mcyJ是O-甲基化酶，mcyF是消旋酶，mcyI是脱氢酶，mcyH是ATP依赖的跨膜转运蛋白。如图4所示，mcyA-C构成一个操纵子，mcyD-J构成另一个操纵子。由于基因簇长度太大，不可能通过一次PCR的方式将整个基因簇扩增下来。因此，参照流程图5，我们采用以下步骤来合成该基因簇：3.1双向启动子3’端的延长为了有利于mcy基因簇的合成，我们在构建双向启动子的过程中，在两个psbA2的3’端分别连接mcyA和mcyD的5’端的约80bp序列，最终形成的带有基因片段的双启动子结构如图6所示。3.2克隆A级片段以微囊藻基因组为模板，设计引物扩增DNA片段，将mcy基因簇本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种使不产毒微藻产生微囊藻毒素的方法，其特征在于，包括在不产毒微藻中表达mcy基因簇中各基因的步骤。

【技术特征摘要】
1.一种使不产毒微藻产生微囊藻毒素的方法，其特征在于，包括在不产毒微藻中表达mcy基因簇中各基因的步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不产毒微藻为聚球藻。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：向聚球藻中转入所述mcy基因簇中各基因的表达框，得到mcy聚球藻；S2：培养所述mcy聚球藻，收获mcy聚球藻藻细胞；S3：从所述mcy聚球藻藻细胞中提取微囊藻毒素。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S1中所述mcy基因簇中各基因的表达框通过质粒载体转入所述聚球藻中。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S1包括以下步骤：S11：将所述mcy基因簇中各基...

【专利技术属性】
技术研发人员：王强，郑彦丽，
申请(专利权)人：武汉藻优生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42