红花CtXTH1基因、其编码蛋白质及应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，具体是红花CtXTH1基因及其编码蛋白质在提高红花花冠长度及产量中的应用。本发明专利技术首次证实了红花CtXTH1基因能促进红花花冠伸长，CtXTH1通过转基因的方法转入红花中，可以显著提高花冠长度以及花冠产量，种子重也有增大趋势，且对红花花冠中主要黄酮类成分无显著影响。

Safflower CtXTH1 Gene, Its Coding Protein and Its Application

【技术实现步骤摘要】
红花CtXTH1基因、其编码蛋白质及应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体地说，是红花CtXTH1基因、其编码蛋白质及应用。
技术介绍
传统中药红花(CarthamiFlos)具有活血通经、散瘀止痛的功效，目前红花及其制剂多用于心脑血管疾病的防治工作。红花药效成分主要为黄酮类化合物，包括羟基红花黄色素A(HSYA)、Carthamin、山萘酚及其苷类等。但红花以花入药，其产量较低。在我国最大的红花产地新疆，每公顷产量仅约为180kg～225kg，且存在严重的品种退化问题。因此发掘与红花花冠发育相关的基因或蛋白质，并将其用于高产红花育种工作具有重要的价值。植物细胞壁是植物细胞的一种独特结构，它为植物细胞提供基础的支撑和保护作用，同时也成为限制植物细胞大小和分裂的一个关键因素。据报道膨胀素(EXP)和木葡聚糖内切转葡糖基/水解酶(XTH)是直接作用于植物细胞壁基质多糖半纤维素的两类重要酶蛋白，影响植物细胞壁的松弛与重构，在种子萌发、根系建成、茎叶的生长、花和果实的发育成熟以及非生物胁迫响应等方面具有重要的作用。但关于红花膨胀素以及木葡聚糖内切转葡糖基/水解酶基因尚未有见报道，其对红花花冠发育以及产量是否有影响仍不清楚。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供红花CtXTH1基因、其编码蛋白和在提高红花花冠长度及花冠产量中的应用。本专利技术的第一方面，提供一种红花CtXTH1(木葡聚糖内切转葡糖基/水解酶)基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述的红花CtXTH1基因全长1176bp，其开放阅读框(ORF，OpenReadingFrame)区包含了888bp，编码295个氨基酸，开放阅读框的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术的第二方面，提供一种红花CtXTH1蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的第三方面，提供红花CtXTH1基因的启动子序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术的第四方面，提供一种重组表达载体、重组菌或转基因植物，所述的重组表达载体、重组菌或转基因植物含有上述红花CtXTH1基因SEQIDNO.1或其开放阅读框SEQIDNO.3。优选的，在制备所述的重组表达载体、重组菌或转基因植物时，用于扩增红花CtXTH1基因开放阅读框的引物对分别如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示：CtXTH1F：GAGCTTTCGCGGATCCGCCACCATGACATATTCGTCGA(SEQIDNO.5)；CtXTH1R：TCCTCGCCCTTGCTCACCATGGTGGCGGCCGCAATCCCATCCATAC(SEQIDNO.6)。优选的，所述的重组表达载体为植物表达载体。更优选真核表达载体pMT39。优选的，所述的重组菌，即宿主细胞，为大肠杆菌、农杆菌等。优选为农杆菌。更优选农杆菌GV3101。本专利技术的第五方面，提供上述的红花CtXTH1基因在提高红花花冠长度及花冠产量中的应用。优选的，所述的红花CtXTH1基因显著提高红花花冠长度以及花冠产量，种子重量也有增大趋势，但对红花花冠主要药效成分无显著影响。本专利技术的第六方面，提供上述的红花CtXTH1蛋白在提高红花花冠长度及花冠产量中的应用。优选的，所述的红花CtXTH1蛋白显著提高红花花冠长度以及花冠产量，种子重量也有增大趋势，但对红花花冠主要药效成分无显著影响。本专利技术的第七方面，提供一种提高红花花冠长度及花冠产量的转基因方法，所述的提高红花花冠长度及产量的转基因方法是将含有上述红花CtXTH1基因或其开放阅读框的重组菌采用农杆菌介导的花粉管通道法遗传转化红花。花粉管通道法在1983年被我国学者周光宇第一次提出；孙毅在1999年通过超声处理花粉粒对其转化方法进行了优化；王丕武在2012年通过添加DNA保护剂对其转化方法进行了优化。目前，该技术已成功应用于玉米、水稻、棉花以及高粱等农作物转基因工作。我们在此基础上，建立了农杆菌介导的花粉管通道法并成功将其用于组织再生困难的红花遗传转化工作。([1]ZhouG,WengJ,ZengY,HuangJ,QianS,LiuG.IntroductionofexogenousDNAintocottonembryos.MethodsEnzymol.1983,(101):433-481.[2]孙毅,王景雪,崔贵梅.超声波处理花粉介导植物基因转化方法:中国,CN99121152[P].2000-04-12.[3]:王丕武,付永平,张君,曲静,姚丹,马建,王鑫雨,单睿,关淑艳.一种改进的植物花粉管转化方法:中国,CN201210406418[P].2014-04-30.)。优选的，包括以下步骤：A、构建含有上述红花CtXTH1基因或其开放阅读框的重组表达载体；B、用步骤A构建的重组表达载体转化农杆菌，得到重组菌；C、步骤B得到的重组菌通过花粉管通道法转化盛开期的红花柱头；D、种子成熟后，采集并种下T0代种子，采集T1代植株花器官，筛选获得转基因阳性植株。更优选的，包括以下步骤：I、载体构建：设计无缝克隆引物扩增CtXTH1的ORF区，扩增引物为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6，构建真核表达载体pMT39，将扩增产物与载体连接后，生成含目的基因的重组载体pMT39-CtXTH1；II、农杆菌介导的转化，具体操作方法为：a.在温室中培育红花植株，温度25℃，昼夜节律为16小时光照/8小时黑暗；b.将步骤I获得的重组载体采用液氮冻融法转入农杆菌GV3101中，在LB+卡那霉素+利福平固体培养基上进行筛选，PCR鉴定得到阳性克隆菌，在LB+卡那霉素+利福平液体培养基大摇至菌液OD600约为0.8；菌液5000rpm，离心5分钟，弃去上清；c.用5％蔗糖溶液重悬菌体，并加入0.02％的表面活性剂silwet-77；d.用微量注射器吸取含目的基因的重悬菌液转化盛开期的红花柱头，转化结束后，立即将花用牛皮纸密封，重复操作，直至花朵闭合，取下牛皮纸，让植株恢复原来的生长环境；e.待种子成熟后，采集获得T0代种子，翻土施肥后，种下T0代种子，待T1代植株花盛开时采集花器官样品；f.设计引物SEQIDNO.7和SEQIDNO.8进行基因组水平验证，筛选出转基因阳性植株。本专利技术的第八方面，提供一种采用上述的提高红花花冠长度及花冠产量的转基因方法获得的红花转基因植株或种质。本专利技术优点在于：本专利技术首次证实了红花CtXTH1参与红花花冠发育，CtXTH1通过转基因方法转入红花中，可以显著增加花冠长度以及花冠产量，种子重也有增大趋势，且其对红花花冠主要药效成分无显著影响。附图说明图1.CtXTH1编码的氨基酸序列与红花及拟南芥中XTHs编码的氨基酸序列的同源比对结果。图2.CtXTH1编码的氨基酸序列与红花及拟南芥中XTHs编码的氨基酸序列的系统进化树分析。图3.CtXTH1基因启动子顺式作用元件分析图4.红花过表达CtXTH1的载体图谱：pMT39-CtXTH1。图5.过表达CtXTH1对红花花冠长度的影响。A：过表达CtXTH1阳性植株CtXTH1基因转录水平测定；B：过表达CtXTH1阳性植株花冠长度统计，每个过表达系与空载对照组进行比较，数据展示为mean±SD，**P<0.01；C：过表达CtX本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种红花CtXTH1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种红花CtXTH1基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的红花CtXTH1基因，其特征在于，所述的红花CtXTH1基因的开放阅读框的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。3.一种红花CtXTH1蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。4.红花CtXTH1基因的启动子序列CtXTH1-Promoter，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。5.一种重组表达载体、重组菌或转基因植物，其特征在于，所述的重组表达载体、重组菌或转基因植物含有红花CtXTH1基因SEQIDNO.1或其开放阅读框SEQIDNO.3。6.根据权利要求5所述的重组表达载体、重组菌或转基因植物，其特征在于，在制备所述的重组表达载体、重组菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭美丽，贾鑫磊，高越，郭丹丹，何贝轩，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海,31