RFP标记小细胞肺癌细胞系及其建立和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种RFP标记小细胞肺癌细胞系及其建立和应用。以小细胞肺癌LTEP‑P细胞株为母细胞，转染包装有表达RFP的pLEIN逆转录病毒，再经G418抗性筛选，获得稳定持续表达RFP的小细胞肺癌LTEP‑P细胞系。该RFP标记小细胞肺癌LTEP‑P细胞系肿瘤特性稳定，具有特异性胸腔内高转移的特点，能够稳定持续表达RFP使得其易于被观察，便于在肺癌转移的各阶段进行实时显示、跟踪、计算和测量等研究工作。

RFP-labeled small cell lung cancer cell line and its establishment and Application

【技术实现步骤摘要】
RFP标记小细胞肺癌细胞系及其建立和应用
本专利技术属于细胞系领域，具体涉及小细胞肺癌细胞系及其建立和应用。
技术介绍
肺癌是发病率最高的恶性肿瘤，是癌症防治的重点。肺癌按组织病理学可以分为小细胞肺癌(Small-celllungcancer，SCLC)和非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)。小细胞肺癌的癌细胞多为类圆形或菱形，胞浆少，类似淋巴细胞，可能是起源于神经外胚层的Kulchitsky细胞或者嗜银细胞。胞浆中含有神经内分泌颗粒，具有内分泌和化学受体功能，能分泌多种肽类物质，可引起类癌综合症。流行病学统计显示：小细胞肺癌约占所有肺癌总数的15％左右；未经治疗的小细胞肺癌患者的中位生存期仅为2到3个月。小细胞肺癌的发病与烟草吸食密切相关。因此，在东欧和亚洲等烟草消费量大的地区，小细胞肺癌的发病率长期保持在较高水平。在临床上，小细胞肺癌虽然对化疗较敏感，但相比较其他类型肺癌而言，小细胞肺癌在临床上表现为肿瘤侵染性强，具有快速生长、早期转移的特点，其发生转移的时间早，转移率高，病程进展快，预后差，长期生存率很低。小细胞肺癌几乎可以向全身各个脏器进行转移，尤其以中枢神经系统、骨骼、肝脏等最为好发。90％以上的小细胞肺癌患者在就诊时就已经发生胸腔内转移(纵隔淋巴结或肺内转移)，2/3以上的患者甚至出现脑、骨、肝等远处转移。因此，肿瘤转移成为小细胞肺癌治疗所面临的棘手问题。肿瘤转移是恶性肿瘤的基本生物学特征之一，高达95％以上的小细胞肺癌患者最终将因肿瘤转移或疾病复发而死亡。因此，探索小细胞肺癌侵袭转移与复发的机制，寻求有效抑制小细胞肺癌转移与复发的药物具有重要意义。目前，人们对肿瘤转移过程，特别是早期过程的认识和了解仍十分欠缺，只从肿瘤患者临床观察中积累资料或寻找线索是相当有限的。要想了解肿瘤转移早期阶段所发生的各种改变及其分子机理，从而有效地进行干预非常困难。而任何新的肿瘤防治方法和措施(包括新的抗癌药物、手术方法、射线剂量及投照部位和方法等)未经动物实验便在肿瘤患者身上试用是不道德的甚至是违法的。因此，肿瘤细胞模型和动物模型在肿瘤转移机理的基础研究及抗癌新方法的疗效观察和评估中是绝对不可缺少的。就小细胞肺癌而言，建立高转移小细胞肺癌细胞模型和动物模型是研究小细胞肺癌的复发与转移规律、评价抗小细胞肺癌药物疗效的基础。目前，对于小细胞肺癌细胞的转移研究主要集中在骨转移、脑转移等远处转移，研究小细胞肺癌的特异性胸腔转移对于小细胞肺癌的早期诊断可能具有特别重要的潜在意义，而且对于小细胞肺癌的特异性转移机制的研究也有重要的意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种红色荧光蛋白(RedFluorescentProtein,RFP)标记小细胞肺癌LTEP-P细胞系及其建立和应用。该RFP标记小细胞肺癌LTEP-P细胞系肿瘤特性稳定，具有特异性胸腔内高转移性的特点，能够稳定持续表达红色荧光蛋白使得其易于被观察，便于在肺癌转移的各阶段进行实时显示、跟踪、计算和测量等研究工作。为此，本专利技术采取了以下技术方案：一种RFP标记小细胞肺癌LTEP-P细胞系，是以小细胞肺癌LTEP-P细胞株为母细胞，转染包装有RFP的pLEIN逆转录病毒，再经G418抗性筛选，获得稳定持续表达红色荧光蛋白(RFP)的小细胞肺癌LTEP-P细胞系。所述RFP标记小细胞肺癌LTEP-P细胞系，又记为LTEP-P-RFP肿瘤细胞，呈近于圆形，透亮，具有强的体外成瘤能力和特异胸腔内高转移性。上述RFP标记小细胞肺癌LTEP-P细胞系通过以下方法建立：将包装细胞PT67与含RFP基因的pLEIN质粒共培养以转染包装细胞PT67，再经G418抗性筛选，获得产病毒RFP阳性细胞克隆(即，细胞克隆中含有表达RFP的pLEIN逆转录病毒载体)；用所述产病毒RFP阳性细胞克隆转染小细胞肺癌LTEP-P细胞株，再经G418抗性筛选，获得所述RFP标记小细胞肺癌LTEP-P细胞系。进一步，上述RFP标记小细胞肺癌LTEP-P细胞系通过以下方法建立：(1)将包装细胞PT67培养至70％-80％汇合度时，与转染试剂和含RFP基因的pLEIN质粒充分浸润，在室温(25℃)共同混合孵育18小时后，置37℃、5％CO2孵箱中培养48小时，再转入含200～1000μg/mlG418的RPMI1640培养液中置于37℃、5％CO2孵箱中培养7天，然后，转入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中并置于37℃、5％CO2孵箱中培养18小时，得到含病毒载体的PT67细胞上清液(简称为病毒上清，其中病毒载体为高表达RFP的pLEIN逆转录病毒载体)；(2)分离步骤(1)所得的PT67细胞上清液，并收集其中的病毒载体进行滴度测定，确定含有最佳病毒感染浓度的病毒载体的细胞上清液(也可称为具有最佳病毒感染浓度的PT67细胞上清液)待用；(3)小细胞肺癌LTEP-P细胞生长至对数期时，用步骤(2)所确定的具有最佳病毒感染浓度的细胞上清液与RPMI1640培养液按照1:1的体积比混合，共培养72小时；72小时后胰酶消化，1:1传代培养于含200μg/mlG418的RPMI1640培养液中，培养过程中G418浓度逐步提高到800μg/ml；用克隆环分离表达RFP的克隆细胞，在含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中置于37℃、5％CO2、饱和湿度中培养扩增，收集LTEP-P-RFP肿瘤细胞。在本专利技术的一具体实例中，步骤(1)中，所述的转染试剂为N-[1-(2,3-二油酰基)]-N,N,N-三甲胺丙烷甲基硫酸盐。在本专利技术的一具体实例中，步骤(1)中，所述的转染试剂为N,N,N-三甲基-3-(2-甲基烯丙酰氨基)-1-氯化丙铵硫酸盐。在本专利技术中，所述pLEIN质粒含增强RFP基因和抗新霉素(Neo)基因双顺反子，二者通过内部核糖体进入位点连接。另外，本专利技术还提供了如上所述的RFP标记小细胞肺癌LTEP-P细胞系的应用，包括但不限于：所述的RFP标记小细胞肺癌LTEP-P细胞系用于在裸鼠中产生小细胞肺癌瘤块。所述的裸鼠优选BALB/c-Nude裸鼠。所述的RFP标记小细胞肺癌LTEP-P细胞系在建立小细胞肺癌裸鼠模型中的应用。所述的RFP标记小细胞肺癌LTEP-P细胞系在作为小细胞肺癌发生、小细胞肺癌发展或小细胞肺癌转移的细胞模型中的应用。所述的RFP标记小细胞肺癌LTEP-P细胞系在研究小细胞肺癌发生机理、耐药机理或筛选治疗小细胞肺癌药物中的应用。其中，所述的RFP标记小细胞肺癌LTEP-P细胞系在建立小细胞肺癌裸鼠模型中的应用，可以采用如下所示的方法：①收集生长良好的LTEP-P-RFP肿瘤细胞接种到裸鼠皮下，3周后肿瘤生长至0.8cm×1.0cm×1.2cm时取出肿瘤组织；②将步骤①的肿瘤组织的碎块肺原位接种在裸鼠肺内，1周后裸鼠肺内见肿瘤生长并取出肿瘤组织；③将步骤②的肿瘤组织的碎块肺原位接种在裸鼠肺内，隔天用小动物活体荧光成像仪在激发488nm发射507nm波段下对裸鼠的肺部进行非侵袭性的实时成像观察，在裸鼠体内观察到胸腔内转移时取出转移灶；④将步骤③的转移灶的碎块肺原位接种在裸鼠肺内，隔天用小动物活体荧光成像仪在激发488nm发射507n本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种RFP标记小细胞肺癌LTEP‑P细胞系，其特征在于，是以小细胞肺癌LTEP‑P细胞株为母细胞，转染包装有RFP的pLEIN逆转录病毒，再经G418抗性筛选，获得稳定持续表达红色荧光蛋白的小细胞肺癌LTEP‑P细胞系。

【技术特征摘要】
1.一种RFP标记小细胞肺癌LTEP-P细胞系，其特征在于，是以小细胞肺癌LTEP-P细胞株为母细胞，转染包装有RFP的pLEIN逆转录病毒，再经G418抗性筛选，获得稳定持续表达红色荧光蛋白的小细胞肺癌LTEP-P细胞系。2.如权利要求1所述RFP标记小细胞肺癌LTEP-P细胞系的建立方法，其特征在于，包括：将包装细胞PT67与含RFP基因的pLEIN质粒共培养以转染包装细胞PT67，再经G418抗性筛选，获得产病毒RFP阳性细胞克隆；用所述产病毒RFP阳性细胞克隆转染小细胞肺癌LTEP-P细胞株，再经G418抗性筛选，获得所述RFP标记小细胞肺癌LTEP-P细胞系。3.如权利要求2所述的建立方法，其特征在于，包括：(1)将包装细胞PT67培养至70％-80％汇合度时，与转染试剂和含RFP基因的pLEIN质粒充分浸润，在室温共同混合孵育18小时后，置37℃、5％CO2孵箱中培养48小时，再转入含200～1000μg/mlG418的RPMI1640培养液中置于37℃、5％CO2孵箱中培养7天，然后，转入含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中并置于37℃、5％CO2孵箱中培养18小时，得到含病毒载体的细胞上清液；(2)分离步骤(1)所得的细胞上清液，并收集其中的病毒载体进行滴度测定，确定最佳病毒感染浓度，相应的细胞上清液待用；(3)小细胞肺癌LTEP-P细胞生长至对数期时，用步骤(2)所确定的具有最佳病毒感染浓度的细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢红阳，姜志明，刘小珍，
申请(专利权)人：浙江省肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：浙江,33