人工靶向修饰的CAR-T细胞及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及生物工程技术领域，尤其涉及代谢修饰的CAR‑T细胞及其制备方法与应用。本发明专利技术通过生物正交代谢修饰，在活体内可以有效地将CAR‑T细胞靶向拉近至肿瘤部位；而体内这种靶向与拉近造成CAR‑T细胞上特异性CAR分子在肿瘤部位与肿瘤抗原结合，从而刺激CAR‑T细胞特异性活化，达到更为高效的肿瘤杀伤能力。

Artificially Targeted Modified CAR-T Cells and Their Preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
人工靶向修饰的CAR-T细胞及其制备方法与应用
本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及人工代谢修饰的CAR-T细胞及其制备方法与应用。
技术介绍
过继细胞疗法(ACT)是一种有效的抗癌策略。工程化表达嵌合抗原受体(ChimericAntigenReceptors，CARs)的T细胞，被称为“活的药物”，在癌症免疫治疗中表现出显著的疗效，特别是在治疗血癌方面取得了巨大成功。然而，作为一种单一疗法，CAR-T细胞免疫治疗在有效性与安全性方面仍然面临着巨大挑战。“脱靶效应”引发的毒性并导致正常的B细胞发育不良是CAR-T细胞疗法的重要潜在副作用。另一个主要障碍是肿瘤免疫逃逸已成为CAR-T细胞治疗实体恶性肿瘤成功的主要障碍。肿瘤细胞通过选择性突变改变或隐藏肿瘤抗原，从而逃避免疫细胞的识别与捕获。因此，针对上述技术瓶颈的成功治愈肿瘤可能需要一种“超级CAR-T细胞”，其已被设计为克服许多晚期实体瘤的免疫抑制环境。为了克服这些挑战，用基因工程和化学改造、修饰CAR-T细胞是一种提高抗癌治疗效果和提高生物安全性的新策略。有研究表明，可以通过基因工程的办法将构建多靶点的CAR靶向识别，提高细胞治疗的安全性与有效性；据报道，免疫细胞和肿瘤细胞之间的紧密接触对细胞间免疫识别、通讯、活化和最终细胞毒性至关重要。在自然界中，接触相互作用通常通过一系列表面粘附分子和连接来实现，并且人工化学修饰是细胞-细胞靶向和连接的重要策略之一。这些技术通过添加特殊的人工靶向，增强CAR-T细胞与肿瘤之间的相互作用，为CAR-T细胞修饰提供了全新思路。目前增强CAR-T细胞功能活性的改造技术主要有基因工程与纳米技术修饰。一些传统的基因改造技术，通常在设计与操作上非常繁琐，如CAR-T细胞中插入多靶点的CAR基因或者黏附分子均存在各自的优缺点。多靶点的CAR-T细胞可以增强T细胞的靶向治疗效果，但插入过多的外源基因会存在影响T细胞活性的潜在风险；通过直接修饰黏附分子或化学基团可以增强CAR-T细胞对肿瘤组织的趋向与识别。然而，直接对CAR-T细胞进行化学靶向修饰，通常会导致细胞活性降低，运动与迁移能力受损。现阶段这些CAR-T细胞工程改造技术主要存在的问题是降低细胞的生物功能活性，不能很好的解决肿瘤脱靶效应的难题，同时也存在一定对机体的潜在毒副作用。针对这些技术瓶颈，现急需开发出一种安全，有效的CAR-T肿瘤靶向治疗技术，克服细胞治疗过程中的脱靶现象与肿瘤免疫抑制。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供代谢修饰的CAR-T细胞及其制备方法与应用；经修饰的CAR-T细胞能够增强对实体瘤的杀伤能力。本专利技术提供的代谢修饰的CAR-T细胞，所述CAR-T细胞的细胞膜表面标记偶联有修饰物的生物活性分子；其中，所述修饰物为叠氮、-BCN或炔基；所述生物活性分子为单糖，脂类或氨基酸。本专利技术提供的经代谢修饰的CAR-T细胞，是一种携带化学报告基团(-N3/-BCN/-Tz/-炔基)的糖/脂/氨基酸衍生物。采用化学合成将化学报告基团引入单糖、胆碱与甲硫氨酸等代谢物质中，形成可以进行细胞代谢的糖/脂/氨基酸衍生物。CAR-T细胞与肿瘤细胞可通过细胞代谢工程将上述配对的化学基团嵌入到各自的细胞膜表面，通过特异的生物正交反应CAR-T细胞可特异识别靶向肿瘤，拉近CAR-T细胞与肿瘤细胞的空间距离，增强细胞间的相互作用，从而激活CAR-T细胞杀伤肿瘤。本专利技术实施例中，所述修饰物为叠氮；所述单糖为甘露糖、葡萄糖，半乳糖或唾液酸；所述氨基酸为甲硫氨酸、丙氨酸或苯丙氨酸；所述脂类为胆碱、胆固醇或脂肪酸。一些实施例中，偶联有修饰物的生物活性分子为Ac4GalNAz、Ac4GlcNAz、Ac4ManNAz、Ac4ManNBCN、Ac4GalNAl、Ac4GlcNAl、Ac4ManNAl、AE-Cho、AP-Cho、Az-Phe、AHA或HPG。一个具体实施例中，所述偶联有修饰物的生物活性分子为AE-Cho。具体的，偶联有修饰物的生物活性分子的结构式如下：本专利技术中，所述的生物活性分子修饰于CAR-T细胞细胞膜表面的糖蛋白/磷脂分子上。本专利技术所述CAR-T细胞的制备方法，包括：将CAR-T细胞与所述生物活性分子于37℃共同孵育后，以PBS清洗，制得代谢修饰的CAR-T细胞。优选的，共同孵育的时间为48h。具体的，CAR-T细胞经过叠氮化的糖/脂/氨基酸类衍生物共孵育48h，通过T细胞糖代谢工程，将叠氮基团嵌入CAR-T细胞膜表面，从而获得叠氮修饰的CAR-T细胞(N3-CAR-T)；本专利技术提供的代谢修饰的CAR-T细胞适用于新型的细胞代谢衍生物和一种基于代谢工程与“生物正交反应”(BioorthogonalReaction)的CAR-T细胞肿瘤靶向治疗技术。本专利技术提供的代谢修饰的CAR-T细胞中的生物活性分子是以叠氮、-BCN或炔基修饰的脂类、糖类或氨基酸，T细胞或肿瘤细胞则与脂类/单糖/氨基酸的基团衍生物小分子共孵育，使其小分子基团(-N3/-BCN/-炔基)通过细胞内糖/脂/氨基酸代谢途径标记在各自的细胞膜表面糖蛋白/磷脂分子上。在体内CAR-T细胞表面的-N3/-BCN/-炔基报告基团与肿瘤细胞膜表面配对的-BNC/-N3基团发生高效、特异的“生物正交反应”，形成稳定共价结合，从而有效拉近CAR-T细胞与肿瘤距离，提高CAR-T细胞对肿瘤抗原的识别与活化，增强CAR-T细胞的抗肿瘤效应。本专利技术所述的CAR-T细胞在制备细胞免疫治疗的制剂中的应用。本专利技术还提供了一种细胞免疫治疗的制剂，其包括(I)或(II)中的任一项：(I)本专利技术所述的CAR-T细胞；(II)CAR-T细胞以及偶联有修饰物的生物活性分子；其中，所述修饰物为叠氮、-BCN或炔基；所述生物活性分子为单糖，脂类或氨基酸。所述的细胞免疫治疗的制剂，还包括与所述生物活性分子产生生物正交反应的代谢衍生物。一些实施例中，所述代谢衍生物为BCN修饰的糖类、脂类或氨基酸。一个具体实施例中，所述代谢衍生物为Ac4ManNBCN。一些具体实施例中，所述细胞免疫治疗的制剂包括：偶联有AE-Cho的CAR-T细胞和Ac4ManNBCN。在此实施例中，所述细胞免疫治疗的制剂还包括荧光素酶。本专利技术还提供了一种基于生物正交反应的CAR-T细胞靶向治疗技术。细胞免疫治疗的制剂中，包含本专利技术所述的CAR-T细胞，则所述靶向治疗技术为，先对靶细胞进行修饰，然后与专利技术所述的CAR-T细胞接触。细胞免疫治疗的制剂中，包含CAR-T细胞以及偶联有修饰物的生物活性分子，则先以生物活性分子修饰CAR-T细胞；在对靶细胞进行修饰，然后使经修饰的CAR-T细胞与经修饰的靶细胞接触。CAR-T细胞表面修饰叠氮基团，则靶细胞表面修饰BCN基团。一些实施例中，靶细胞的修饰包括：将将BCN修饰的糖类衍生物代谢处理肿瘤细胞(共孵育48h)与组织(瘤内注射3次)，通过细胞糖代谢工程，将BCN基团嵌入肿瘤细胞与组织表面，从而获得BCN修饰的肿瘤细胞与组织(BCN-tumor)。本专利技术公开了一种基于细胞代谢工程与生物正交靶向的CAR-T细胞免疫治疗技术。该技术通过细胞代谢构建CAR-T细胞与肿瘤识别的人工化学靶点，在体内通过高效、特异的生物正交反应，提本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.代谢修饰的CAR‑T细胞，所述CAR‑T细胞的细胞膜表面标记偶联有修饰物的生物活性分子；其中，所述修饰物为叠氮、‑BCN或炔基；所述生物活性分子为单糖，脂类或氨基酸。

【技术特征摘要】
1.代谢修饰的CAR-T细胞，所述CAR-T细胞的细胞膜表面标记偶联有修饰物的生物活性分子；其中，所述修饰物为叠氮、-BCN或炔基；所述生物活性分子为单糖，脂类或氨基酸。2.根据权利要求1所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述修饰物为叠氮；所述单糖为甘露糖、葡萄糖，半乳糖或唾液酸；所述氨基酸为甲硫氨酸、丙氨酸或苯丙氨酸；所述脂类为胆碱、胆固醇或脂肪酸。3.根据权利要求1所述的CAR-T细胞，其特征在于，偶联有修饰物的生物活性分子为Ac4GalNAz、Ac4GlcNAz、Ac4ManNAz、Ac4ManNBCN、Ac4GalNAl、Ac4GlcNAl、Ac4ManNAl、AE-Cho、AP-Cho、Az-Phe、AHA或HPG。4.根据权利要求1～3任一项所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述的生物活性分子修饰于CAR-T细胞细胞膜表面的糖蛋白/磷脂分子上。5.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡林涛，潘宏，马轶凡，李文军，罗英梅，王芳芳，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44