卡波氏肉瘤相关病毒蛋白ORF57的C端片段其抗体制备方法和应用技术

本发明专利技术公开一种卡波氏肉瘤相关病毒蛋白ORF57的C端片段其抗体制备方法和应用。通过克隆该多肽片段的基因并实现原核表达，纯化后得到该多肽片段。以该多肽片段作为抗原，制备兔抗血清，分离纯化抗血清，获得抗ORF57蛋白的多克隆抗体。细胞学和分子生物学实验研究表明，该抗体能够在细胞内和细胞外特异性结合ORF57蛋白，能够检测到进入细胞核内的ORF57蛋白。因此，该多克隆抗体可以用于卡波氏肉瘤相关病毒抗原的检测识别中或制备检测活病毒感染的检测试剂盒。

Preparation and application of C-terminal fragment of ORF57 protein of Kaposi sarcoma-associated virus

【技术实现步骤摘要】
卡波氏肉瘤相关病毒蛋白ORF57的C端片段其抗体制备方法和应用
本专利技术涉及生物医学领域，具体涉及卡波氏肉瘤相关病毒的ORF57蛋白的C端片段的多克隆抗体制备方法和应用。
技术介绍
卡波氏肉瘤(Kaposi'ssarcoma，KS)是一种艾滋病(AcquiredImmuneDeficiencySyndrome，AIDS)患者常见的并发症。卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’ssarcoma-associatedherpesvirus，KSHV)；也被称为人类疱疹病毒8型(Humanherpesvirus8，HHV8)是该肿瘤的病原体。此外KS也是许多非洲亚赤道地区国家最常见的癌症之一。人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)的感染被认为是一种最重要的因素，可以显著提高KS发生的风险。KS的发病率在普通人群中是1/100,000，在HIV感染人群中上升至1/20，在HIV感染的男性同性恋人群中攀升至1/3。同时感染HIV和KSHV的男性如果没有接受有效治疗，有50％的可能在十年内发展为KS。KS主要由梭形细胞，异常增生的血管和炎性细胞浸润组成。KSHV有两相生活周期：潜伏期和裂解期。KSHV可以根据环境调控两相生活周期。病毒裂解期发生时，开放阅读框架57蛋白(openreadingframe57，ORF57)在病毒裂解早期表达。蛋白ORF57可以提高病毒mRNA的稳定性从而促进KSHV完成裂解复制，缺失ORF57基因的病毒不能有效的产生成熟的病毒粒子。研究还发现ORF57调控白介素6和多种宿主蛋白的表达，抑制宿主细胞抗病毒防御。因此ORF57蛋白对于KSHV的感染起重要重要作用。目前对蛋白ORF57的功能和生物特性的研究成果还很少，进一步深入研究需要针对该蛋白的特异性抗体，目前还未有的商品供应。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种针对卡波氏肉瘤相关疱疹病毒蛋白ORF57的C端片段。本专利技术的目的之二在于提供该疱疹病毒蛋白的C端片段的编码蛋白。本专利技术的目的之三在于提供包含该C端片段的载体。本专利技术的目的之四在于提供该C端片段的的克隆方法。本专利技术首先针对蛋白ORF57的C端结构域设计了抗原肽段，并对该基因进行分子克隆并实现原核的高效表达。可以获得高纯度的重组蛋白ORF57的C端片段。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种卡波氏肉瘤相关病毒蛋白ORF57的C端片段，其特征在于该片段的的基因为SEQIDNO:1所示的碱基序列。上述的卡波氏肉瘤相关病毒蛋白ORF57的C端片段的基因的编码蛋白，其特征在于该编码蛋白为SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。一种载体，其特征在于该载体含有上述的碱基序列。一种重组质粒，其特征在于该重组质粒包含上述的载体。一种上述的卡波氏肉瘤相关病毒蛋白ORF57的C端片段的克隆方法，其特征在于该方法的具体步骤为：a.设计含有限制性内切酶位点的特异性引物，该特异性引物为SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的碱基序列：b.采用步骤a的特异性引物进行PCR扩增，得到ORF57基因的C端抗原片段并纯化。上述的步骤b中PCR扩增采用1.0mMIPTG,诱导温度为30℃，表达4h。上述的步骤b中采用Ni柱纯化。一种上述的卡波氏肉瘤相关病毒蛋白ORF57的C端片段在检测和识别活病毒感染中的应用。优选地，所述蛋白ORF57的C端片段的基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2。所述蛋白ORF57的C端片段的基因是截取蛋白ORF57全基因中的C端片段部分，通过聚合酶链式反应进行克隆，克隆该基因片段所采用的两条引物分别含有BamHI和XhoI酶切位点，序列分布如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。优选地所述原核表达采用IPTG诱导表达，IPTG的终浓度为1mM,诱导表达时的培养温度为30℃。本专利技术提供了一种上述所述的可溶性重组答辩的纯化方法，所述纯化方法包括如下步骤：通过离心收集表达所述可溶性重组蛋白的大肠杆菌BL21，收集得到的菌体冰浴，经过超声波裂解，分离收集上清液。将上清液后上Ni柱纯化，经洗脱液洗脱可以得到上述可溶性重组蛋白，其有效洗脱液含0.3M咪唑。本专利技术采用上述原核表达蛋白系统制备蛋白ORF57的C端片段抗原。本专利技术提供了一种将上述的蛋白ORF57的C端片段抗原在制备抗ORF57的多克隆抗体中的应用。本专利技术提供了一种制备重组蛋白ORF57的C端片段特异的多克隆抗体方法，该方法包括如下步骤：将重组蛋白ORF57的C端片段作为蛋白抗原与福氏佐剂(Freund’sadjuvant)乳化后，在新西兰大白兔背部皮下多点免疫注射。初次免疫后,再进行3次加强免疫。抗原免疫过程结束后，颈动脉收集兔血，经过凝血，离心分离得到含有特异性兔抗蛋白ORF57的C端片段的抗血清，经蛋白A亲和层析柱进行亲和纯化,得到多克隆抗体。上述方法制备的多克隆抗体在KSHV病毒抗原的检测识别中的应用或在制备检测KSHV活病毒感染的ELISA检测试剂盒中的应用。上述方法制备的多克隆抗体鉴定可以用于WesternBlot分析和免疫荧光分析中对KSHV病毒抗原的检测识别。本专利技术首次对KSHV病毒的ORF57的C端片段基因进行优化，利用原核大肠杆菌表达系统表达该蛋白，可以获得保留特定三维结构的重组蛋白抗原。利用该抗原免疫新西兰大白兔所制备的多克隆抗体可以用于WesternBlot检测和特异识别细胞内的蛋白ORF57。所以ORF57的C端片段抗原肽及其多克隆抗体可以为进一步开发KSHV检测试剂盒奠定基础。附图说明图1为构建的重组质粒pET28a-ORF57-C的PCR鉴定的电泳检测结果。其中1泳道是DNAmarker,2泳道是重组载体经PCR产物。图2为SDS-PAGE电泳显示特异表达的重组蛋白ORF57的C末端结构域抗原肽。其中M泳道是蛋白marker，B泳道是挂柱后琼脂糖基材，E泳道是洗脱液(0.3M咪唑)，W泳道是洗脱液(0.12M咪唑)，O泳道是流穿液，P泳道是包涵体，S泳道是上清液，T泳道是超声波裂解后样品，C泳道是对照组菌体裂解液。图3为特异性多克隆抗体的效价测定。图4为利用Westernblot检测多克隆抗体的特异性。图中M泳道为蛋白Marker,1泳道是对照组，2泳道是表达ORF57蛋白的实验组。图5荧光免疫试验表明多克隆抗体可以特异识别定位于细胞核中的蛋白ORF57。图中：A图是用DAPI染色细胞核，B图是显示细胞核中带绿色荧光的ORF57重组蛋白，C图是利用兔多克隆抗体和红色荧光的二抗标示的细胞核，D图是B图和C图叠后的效果图。具体实施方法下面结合具体实施例,进一步阐述本专利技术。应理解,这些实施例仅用于解释本专利技术,而不用于限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术的技术方案的前提下,对本专利技术所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动都将落入本专利技术的权利要求范围之内。实施例一:蛋白ORF57的C末端结构域抗原肽的表达载体的构建通过PCR技术从KSHV的全长ORF57基因中扩增C末端结构域抗原肽的基因片段序列，核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。设计PCR扩增引物时分别引入DNA限制性内切酶BamHI和XhoI酶切位点，核苷酸序列如SEQIDNO：3。扩增后所获得的基因片段命本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种卡波氏肉瘤相关病毒蛋白ORF57 的C端片段，其特征在于该片段的的基因为SEQ ID NO:1 所示的碱基序列。

【技术特征摘要】
1.一种卡波氏肉瘤相关病毒蛋白ORF57的C端片段，其特征在于该片段的的基因为SEQIDNO:1所示的碱基序列。2.根据权利要求1所述的卡波氏肉瘤相关病毒蛋白ORF57的C端片段的基因的编码蛋白，其特征在于该编码蛋白为SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。3.一种载体，其特征在于该载体含有根据权利要求1所述的碱基序列。4.一种重组质粒，其特征在于该重组质粒包含根据权利要求3所述的载体。5.一种根据权利要求1所述的卡波氏肉瘤相关病毒蛋白ORF57的C端片段的克隆方法，其特征在于该方法的具...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄海，薛辰，蓝柯，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：上海,31