一种用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球及其制备方法和应用。所述磁性微球以磁性纳米颗粒为内核，在其表层形成巯基化壳层，然后在巯基化壳层上连接环境敏感基团，并通过环境敏感基团偶联点击反应基团，即为所述磁性微球。本发明专利技术磁性微球可通过高效的点击反应迅速地与标记蛋白进行结合，并在外源磁场的作用下，从检测样溶液中分离出来，然后在一定环境刺激下释放被标记的蛋白，使得被标记的蛋白可快速、简单地分离出来，且纯度较高，后续检测结果更准确；同时标记蛋白被分离后，待检测样中未被标记的蛋白还可回收并重复进行应用，用于回收修饰/未修饰的蛋白，尤其是抗体类的蛋白质，可大幅度减少蛋白的浪费，降低成本。

An Environmentally Sensitive Magnetic Microsphere for Separation and Purification of Marker Proteins and Its Preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球及其制备方法和应用
本专利技术涉及高分子化学与生物医学工程
，更具体地，涉及一种用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球及其制备方法和应用。
技术介绍
基于免疫侧向层析技术的快检技术具有操作方便、即时快捷和成本较低的优点，在早孕检测、心梗早期诊断和病毒检测等方面得到了广泛应用，实现了床旁快检，对于提高疾病诊断效率起到了积极作用，具有广阔的应用前景和市场价值。然而，在基于免疫侧向层析技术的快检试纸条的工业化生产仍存在问题。在该项技术中，不可避免地要将荧光微球、量子点、荧光染料等标记到抗体表面，在检测中发出信号指示样本中是否含有目标检测物。目前，抗体与信号分子的标记反应通常基于N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和氨基、马来酰亚胺(Mal)和巯基的反应。自点击化学反应提出和发展以来，因为其高效的反应效率及其绿色环保的优势，越来越多地被应用于生物化学反应中，在蛋白及抗体的标记中也有广泛的应用。但是，反应过后，溶液中仍存在许多未被标记的抗体蛋白难以分离、回收，不仅使得生产成本高昂，还会对检测灵敏度造成了很大的影响。而传统的蛋白纯化方法大多为层析法，如亲和层析法、羟基磷灰石柱层析法、纤维柱层析法、离子交换色谱等；其纯化过程需要选择合适的填料粒径、配比合适的洗脱液，且填料价格较高、洗脱溶剂用量较大，导致成本较高；另外，层析法还具有用时较长、操作不便等问题。另外，胰岛素等蛋白类药物在体内输送时易被体液中的酶降解，无法达到治疗效果。因此，需将蛋白类药物表面PEG化，即将活化的PEG通过化学方法偶联到药物上,以保护蛋白类药物不被酶解。然而，蛋白类药物PEG化后溶液中还可能存在聚乙二醇单甲醚、交叉连接或聚合的PEG二醇等物质，难以分离纯化，限制了蛋白类药物PEG修饰技术的应用。因此，有必要提供一种易于快速、准确分离纯化标记蛋白，同时未被标记的蛋白还能有效回收的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有标记蛋白的检测过程中标记蛋白纯化方法的不足，以及未被标记的蛋白无法有效回收的缺陷，提供一种用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球。本专利技术所述环境敏感型磁性微球表面修饰点击反应基团，待检测蛋白采用与磁性微球上相同的点击反应基团标记，然后将信号分子连接与蛋白标记的点击反应基团相对应的点击反应基团，则信号分子可分别与标记蛋白和磁性微球高效点击反应，将标记蛋白与磁性微球偶联，再结合磁珠自身的超顺磁性，在外源磁铁的作用下，与标记蛋白偶联后磁性微球由于磁性的吸引，被分离出反应体系，其后在一定的环境刺激下，标记蛋白与磁性微球之间的偶联被断开，标记蛋白被释放。通过上述方法，得到的标记蛋白的纯度高，纯化过程简单，纯化效率高；同时，反应体系中剩余未标记的蛋白(尤其是抗体)还可回收并再次利用，降低了生产成本。本专利技术的另一目的在于提供所述用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球的制备方法。本专利技术的再一目的在于提供所述用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球的应用。本专利技术的还一目的在于提供所述用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球的应用方法。本专利技术的上述目的是通过以下方案予以实现的：一种用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球，以磁性纳米颗粒为内核，在其表层形成巯基化壳层，然后在巯基化壳层上连接环境敏感基团，并通过环境敏感基团偶联点击反应基团，即为所述用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球。本专利技术所述磁性微球为在纳米磁珠颗粒的表面修饰连接环境敏感键的点击反应基团，通过高效的点击反应结合反应体系中需要被分离的蛋白，利用磁珠的超顺磁性，在外源磁场下即可快速富集，操作简便快捷；受一定环境刺激后，目标蛋白可快速释放，纯度高；所述环境敏感型磁性微球不仅可以代替传统的柱层析等方法达到纯化目的蛋白、回收未反应蛋白的目的，还可以提高纯化效率，简化操作过程，具有很大的优势。优选地，所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒、掺杂锰元素的四氧化三铁纳米颗粒或γ-三氧化二铁纳米颗粒中的一种或多种。优选地，所述环境敏感基团为酰腙键、腙键、亚胺键、原酸酯键或缩醛键中的一种或多种。优选地，所述点击反应基团为氮杂二苯并环辛炔(DBCO)、叠氮(N3)、端基炔、马来酰亚胺(Mal)、巯基或呋喃的一种或多种。优选地，所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒；所述环境敏感基团为酰腙键；所述点击反应基团为氮杂二苯并环辛炔(DBCO)或叠氮(N3)。本专利技术同时还保护所述用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球的制备方法，包括以下步骤：S1.将磁性纳米颗粒经巯基硅烷化试剂获得巯基化的磁性纳米颗粒(Fe3O4@SiO2-SH)；S2.将含有环境敏感基团的物质与含有点击反应基团的物质反应，制备同时含有环境敏感基团和点击反应基团的物质；S3.将步骤S1制备的巯基化的磁性纳米颗粒和步骤S2制备的含有环境敏感基团和点击反应基团的物质在光引发剂的作用下，经365nm紫外光照射，反应制备得到表面修饰有点击反应基团的环境敏感磁性微球。优选地，步骤S1中所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒。优选地，步骤S2中含有环境敏感基团的物质为烯丙基醛基聚乙二醇或烯丁基醛基聚乙烯醇；所述含有点击反应基团的物质为叠氮丙酰肼、叠氮乙酰肼或氮杂二苯并环辛炔乙酰肼。优选地，步骤S3中所述光引发剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮、2,4,6-三甲基苯甲酰基-二苯基氧化膦或2-二甲氨基-2-苄基-1-[4-(4-吗啉基)苯基]-1-丁酮中的一种。更优选地，步骤S3中所述光引发剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮。更优选地，步骤S2的具体过程为：S21.含有环境敏感基团的物质的制备：以水合肼、溴丙酸甲酯、叠氮化钠等为原料合成小分子的叠氮丙酰肼；或，以水合肼、DBCO-NHS为原料合成氮杂二苯并环辛炔丙酰肼(DBCO)；S22.含有点击反应基团的物质的制备：以烯丙基聚乙二醇(APEG3k-OH)为原料，通过TEMPO选择性氧化，合成烯丙基醛基聚乙二醇(APEG3k-CHO)；S23.同时含有环境敏感基团和点击反应基团的物质的制备：APEG3k-CHO和叠氮丙酰肼为原料，发生席夫碱反应，合成酸敏感的叠氮烯丙基聚乙二醇(APEG3k-pH-N3)，即为同时含有环境敏感基团和点击反应基团的物质；或，APEG3k-CHO和氮杂二苯并环辛炔丙酰肼，发生席夫碱反应，合成氮杂二苯并环辛炔烯丙基聚乙二醇(APEG3k-pH-DBCO)，即为同时含有环境敏感基团和点击反应基团的物质。优选地，步骤S22中，所述烯丙基聚乙二醇氧化的催化剂为以下体系之一：①四甲基哌啶氮氧化物(TEMPO)、溴化钠、次氯酸钠；②四丙基铵·过铑酸盐(TPAP)、碳酸钾；③醋酸钯、吡啶、分子筛。更优选地，步骤S3的具体过程为：Fe3O4@SiO2-SH、APEG3k-pH-N3或APEG3k-pH-DBCO在光引发剂I2959存在条件下，经365nm紫外光照射，发生反应，即可分别制备得到Fe3O4@SiO2-PEG-pH-N3或Fe3O4@SiO2-PEG-pH-DBCO。所述用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球在分离、纯化标记蛋白，回收为标记蛋白的检测过程本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球，其特征在于，以磁性纳米颗粒为内核，在其表层形成巯基化壳层，然后在巯基化壳层上连接环境敏感基团，并通过环境敏感基团偶联点击反应基团，即为所述用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球。

【技术特征摘要】
1.一种用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球，其特征在于，以磁性纳米颗粒为内核，在其表层形成巯基化壳层，然后在巯基化壳层上连接环境敏感基团，并通过环境敏感基团偶联点击反应基团，即为所述用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球。2.根据权利要求1所述用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球，其特征在于，所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒、掺杂锰元素的四氧化三铁纳米颗粒或γ-三氧化二铁纳米颗粒中的一种或多种；所述环境敏感基团为酰腙键、腙键、亚胺键、原酸酯键或缩醛键中的一种或多种；所述点击反应基团为氮杂二苯并环辛炔、叠氮、端基炔、马来酰亚胺、巯基或呋喃的一种或多种。3.根据权利要求2所述用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球，其特征在于，所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒；所述环境敏感基团为酰腙键；所述点击反应基团为氮杂二苯并环辛炔或叠氮。4.权利要求1～3所述用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.将磁性纳米颗粒经巯基硅烷化试剂获得巯基化的磁性纳米颗粒；S2.将含有环境敏感基团的物质与含有点击反应基团的物质反应，制备同时含有环境敏感基团和点击反应基团的物质；S3.将步骤S1制备的巯基化的磁性纳米颗粒和步骤S2制备的含有环境敏感基团和点击反应基团的物质在光引发剂的作用下，经365nm紫外光照射，反应制备得到表面修饰有点击反应基团的环境敏感磁性微球。5.根据权利要求4所述用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒；步骤S2中含有环境敏感基团的物质为烯丙基醛基聚乙二醇或烯丁基醛基...

【专利技术属性】
技术研发人员：程度，黄思聪，袁建明，邓少辉，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44