修饰电极、组合产品及其电致化学发光生物传感器与应用制造技术

本发明专利技术涉及修饰电极、组合产品及其电致化学发光生物传感器与应用。所述修饰电极包括电极以及修饰在所述电极上的发光体；所述发光体主要为羧基功能化的聚[(9,9‑二辛基芴‑2,7‑二基)‑共‑(1,4‑苯并‑{2,1’,3}‑噻二唑)]点。所述电致化学发光生物传感器无共反应试剂，能够克服现有的在共反应试剂存在下进行的ECL生物传感器测定中存在的系统稳定性不足、测量存在误差、检测中缺乏再现性等缺陷，构建了无共反应试剂型的双重信号放大电致化学发光策略，同时具有较理想的ECL信号响应值和优异的ECL发光效率，具有优异的高灵敏性、特异选择性和稳定性，为核酸的检测提供一种新方法。

Modified Electrodes, Composite Products and Their Electrochemiluminescent Biosensors and Applications

【技术实现步骤摘要】
修饰电极、组合产品及其电致化学发光生物传感器与应用
本专利技术涉及生物传感器领域，具体而言，涉及修饰电极、组合产品及其电致化学发光生物传感器与应用。
技术介绍
MicroRNAs(miRNAs)是一种内源性，非蛋白质编码，短(通常约19-25个碱基)和单链的RNAs，已被证实是几种生物过程如造血功能，细胞增殖和细胞凋亡中的重要调节因子。研究表明，miRNA可以作为理想的生物标志物候选物，并且miRNA的异常表达与各种癌症的发生密切相关。因此，迫切需要开发高灵敏，高度特异且可靠的技术来检测miRNA。电致化学发光(ECL)不仅具有电化学方法的优点，例如设备的简单性和稳定性，而且还具有比常规化学发光(CL)更广泛的动态范围和更高的灵敏度。因而已广泛用于环境分析，生物化学检测和临床检测。通常，ECL测定基本都是在共反应试剂存在下进行的。然而，在检测溶液中添加外源性共反应试剂会影响测试溶液的环境，使ECL系统缺乏足够的稳定性，从而导致测量误差。此外，虽然利用溶解氧作为共反应试剂也可以避免添加外源共反应试剂的缺陷，但在溶解氧作为共反应试剂的情况下，未知浓度的溶解氧将导致不可避免的误差并且在检测中缺乏再现性。因此，开发具有高ECL发射效率且无需任何共反应试剂的用于检测miRNAs的灵敏、简单ECL系统具有重要的实际意义。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种修饰电极，所述修饰电极修饰有共轭聚合物点发光体，该电极为表面功能化电极，具有高电荷载流子迁移率、快速辐射率等优势。本专利技术的第二目的在于提供包括上述修饰电极的组合产品，该组合产品是基于无共反应试剂型的双重信号放大电致化学发光(ECL)策略设计的，能够用于构建无共反应试剂型双重信号放大电致化学发光生物传感器。本专利技术的第三目的在于提供由上述组合产品组装得到的电致化学发光生物传感器，所述电致化学发光生物传感器为无共反应试剂型ECL生物传感器，结合双足DNA步行器(walker)双重放大策略，能够克服现有的在共反应试剂存在下进行的ECL生物传感器测定中存在的系统稳定性不足、测量存在误差、检测中缺乏再现性等缺陷，同时具有较理想的ECL信号响应值和优异的ECL发光效率。本专利技术的第四目的在于提供上述电致化学发光生物传感器在检测核酸、尤其是miRNA方面的应用。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：修饰电极，其包括电极以及修饰在所述电极上的发光体。所述发光体主要为羧基功能化的聚[(9,9-二辛基芴-2,7-二基)-共-(1,4-苯并-{2,1’,3}-噻二唑)]点。可选地，所述电极选自玻碳电极、金电极。可选地，所述电极选自玻碳电极。作为一种实施方式，本专利技术中PFBT-COOH点为聚(苯乙烯-马来酸酐)(PSMA)功能化的PFBT点。本申请中修饰电极以共轭聚合物、共轭聚合物点作为发光体，尤其是PFBT和羧基功能化的PFBT-COOH点，这类聚合物和聚合物点具有高电荷载流子迁移率，快速辐射率，易于表面功能化，良好的光稳定性等多种突出特征，这类材料的使用为构建无共反应试剂型的ECL生物传感器提供了一个很好的平台，并扩展了共轭聚合物点在临床分析中的应用。本专利技术中，PFBT-COOH点不仅表现出更高的ECL强度，而且还显示出更优异的成膜能力和稳定性。在不添加任何共反应试剂并用N2除去溶解氧的情况下，在光电倍增管(PMT)的电压设置为800V，放大级数设置为3时，PFBT-COOH点的ECL强度可达到18,000a.u.，信号强度比PS-COOH-co-PFO点的ECL信号响应值高了约5倍，比纯PFBTECL信号响应值高了24倍。因此，PFBT-COOH点为无共反应试剂型的ECL传感平台的构建提供了更为理想的选择。根据本专利技术的另一目的，提供了一种组合产品，其包括上述修饰电极、DNAS1、DNAS2；DNA发夹H1及DNA发夹H2。所述DNAS1及DNAS2能够互补配对，所述DNAS2上偶联有淬灭剂。所述DNA发夹H1及DNA发夹H2能够在待检测核酸催化下组装形成双足DNA步行器；所述双足DNA步行器的双足部分能够与所述DNAS1互补配对，并在所述配对后的DNAS1上预留出DNA外切酶的酶切位点。所述组合产品不包括共反应试剂。可选地，所述组合产品还包括所述DNA外切酶。可选地，所述DNA外切酶为核酸外切酶Ⅲ。可选地，所述猝灭剂选自黑洞淬灭剂、二茂铁。可选地，所述猝灭剂为黑洞淬灭剂。本专利技术中，DNA外切酶，尤其是核酸外切酶Ⅲ(ExoIII)，能够对ECL信号强度进行两步扩增，使得电致化学发光生物传感器获得显著增强的ECL信号，双重扩增策略能赋予传感器更优的信号放大能力。根据本专利技术的另一目的，提供了检测核酸的方法，所述方法包括使用上述组合产品对待检测核酸进行检测。可选地，所述检测核酸的方法包括电致化学发光生物传感器的组装方法：a)以所述修饰电极为基质组装DNAS1，引入与所述DNAS1互补配对的DNAS2；b)在所述待检测核酸催化下，DNA发夹H1及H2组装产生双足DNA步行器；c)将所述双足DNA步行器和所述DNA外切酶与步骤a)中所得电极共孵育；其中，步骤a)与b)无先后顺序。可选地，步骤a)中所述DNAS1在交联剂存在下在所述修饰电极上组装；所述交联剂为EDC和NHS。可选地，所述修饰电极的制备方法包括：将所述发光体的分散液滴涂于所述电极的表面，干燥成膜，得到所述修饰电极。可选地，所述分散液的分散介质选自二次蒸馏水或超纯水。可选地，所述分散液中所述发光体的浓度为0.2mg·mL-1～0.4mg·mL-1。可选地，在所述发光体修饰所述电极之前，还包括电极的预处理。可选地，所述预处理包括：将所述电极进行至少2次抛光，然后在清洗剂存在下进行超声清洗。可选地，所述抛光采用氧化铝抛光；所述氧化铝的粒径不超过0.30μm，并且粒径随抛光次数的增加而降低。可选地，所述清洗剂包括乙醇、水。可选地，所述超声的功率为160～200W，超声时间为2～5分钟。可选地，所述双足DNA步行器的制备过程包括：将DNA发夹H1和DNA发夹H2加热至90℃～100℃下保持5～10分钟，优选加热至95℃下保持5分钟，缓慢冷却至室温，形成发夹结构；将目标物、DNA发夹H1和DNA发夹H2混合得到混合物，并将混合物在25℃～65℃下孵育60～120分钟，优选在37℃下孵育90分钟，获得双足DNA步行器。可选地，所述双足DNA步行器和所述DNA外切酶在所述电极上的孵育时间为1～3小时，优选为2小时。作为一种实施方式，DNAS1以经过发光体修饰的电极为基质进行组装，在不添加任何共反应试剂的条件下以获得强ECL信号；然后，通过与DNAS1杂交引入黑洞猝灭剂(BHQ)标记的DNAS2(BHQ-S2)。由于BHQ对PFBT-COOH信号的高效猝灭作用，ECL信号达到“信号关闭”状态，由此实现了信号转换功能。作为一种实施方式，通过将目标物催化发夹组装产生的双足DNA步行器和DNA外切酶同时孵育到电极上。一方面，BHQ-S2被双足DNA步行器置换以从电极表面释放出来。另一方面，DNA外切酶可以消化双链DNA(dsDNA)中钝的或凹陷的3’末端。在DNA外切酶的帮助下，DNAwalker释放出来再取代本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.修饰电极，其特征在于，包括电极以及修饰在所述电极上的发光体；所述发光体主要为羧基功能化的聚[(9,9‑二辛基芴‑2,7‑二基)‑共‑(1,4‑苯并‑{2,1’,3}‑噻二唑)]点；所述电极选自玻碳电极、金电极；优选地，所述电极选自玻碳电极。

【技术特征摘要】
1.修饰电极，其特征在于，包括电极以及修饰在所述电极上的发光体；所述发光体主要为羧基功能化的聚[(9,9-二辛基芴-2,7-二基)-共-(1,4-苯并-{2,1’,3}-噻二唑)]点；所述电极选自玻碳电极、金电极；优选地，所述电极选自玻碳电极。2.组合产品，其特征在于，包括：权利要求1所述的修饰电极；DNAS1、DNAS2；DNA发夹H1及DNA发夹H2；所述DNAS1及DNAS2能够互补配对，所述DNAS2上偶联有淬灭剂；所述DNA发夹H1及DNA发夹H2能够在待检测核酸催化下组装形成双足DNA步行器；所述双足DNA步行器的双足部分能够与所述DNAS1互补配对，并在所述配对后的DNAS1上预留出DNA外切酶的酶切位点；所述组合产品不包括共反应试剂。3.根据权利要求2所述的组合产品，其特征在于，所述组合产品还包括所述DNA外切酶；所述DNA外切酶为核酸外切酶Ⅲ；所述猝灭剂选自黑洞淬灭剂、二茂铁；优选地，所述猝灭剂为黑洞淬灭剂。4.检测核酸的方法，其特征在于，包括使用权利要求2或3所述的组合产品对待检测核酸进行检测。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括电致化学发光生物传感器的组装方法：a)以所述修饰电极为基质组装DNAS1，引入与所述DNAS1互补配对的DNAS2；b)在所述待检测核酸催化下，DNA发夹H1及H2组装产生双足DNA步行器；c)将所述双足DNA步行器和所述DNA外切酶与步骤a)中所得电...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈时洪，李芹，谭兴容，
申请(专利权)人：西南大学，重庆市沙坪坝区人民医院，重庆市第九人民医院，
类型：发明
国别省市：重庆,50