PCT和IL-6联合检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种PCT和IL‑6联合检测试剂盒及其制备方法。所述试剂盒包含PCT和IL‑6联合检测试纸条，所述试纸条包括样品垫、结合垫、分析膜、吸收垫和底板，所述分析膜上设有2条检测线(PCT、IL‑6检测线)和1条质控线，样品垫、结合垫、分析膜和吸收垫依次搭接地粘贴在底板上且分别部分重合；所述结合垫包被有PCT和IL‑6抗体标记荧光微球。本发明专利技术采用荧光免疫层析法制备的试剂盒，可以同时检测PCT和IL‑6，提高了临床检测效率，具有高灵敏度、高特异性及快速检测的优点，为感染性疾病、组织损伤坏死性疾病等疾病的辅助诊断提供有效手段。

PCT and IL-6 Joint Detection Kit and Its Preparation Method

【技术实现步骤摘要】
PCT和IL-6联合检测试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及医学检测和免疫分析
，具体地说，涉及一种PCT和IL-6联合检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
降钙素原(PCT)和白介素6(IL-6)是感染性疾病的早期炎症指标，对于细菌感染、组织感染的诊断及评估炎症程度十分重要，并且可以为抗生素的选择和疗效的判断提供指示。降钙素原(PCT)是无激素活性的降钙素前肽物质，由116个氨基酸组成、分子量为13kd的糖蛋白。PCT由神经内分泌细胞表达，经酶切分解为降钙素、羧基端肽和氨基端肽。PCT的半衰期为25-30h，体内外稳定性很好。健康人血中的PCT含量很低；而在细菌感染后，患者PCT明显升高。当PCT浓度大于0.5ng/ml时极可能感染细菌，需要使用抗生素治疗。PCT升高常见于严重细菌性炎症和真菌感染，尤其是重度脓毒血症和感染性休克；同时，对于呼吸道感染和诱导性肺炎患者，PCT可作为抗生素选择及疗效观察指标之一。白介素6(IL-6)是一种具有多功能的细胞因子，属于白细胞介素的一种；IL-6由T淋巴细胞、B淋巴细胞、纤维母细胞、及多种瘤细胞产生。IL-1、TND-a和病毒感染等，均可诱导正常细胞产生IL-6，而其可参与细胞增殖、分化。IL-6通常在肝细胞中表达、分泌并调节，人IL-6可与C反应蛋白、血清淀粉样蛋白、纤维蛋白原相互联系。研究表明，该蛋白不仅显示B细胞的活性，而且显示T细胞，造血干细胞，肝细胞和脑细胞的活性；在机体损伤，创伤，压力，感染，脑死亡，瘤形成和其他情况相关的急性炎症反应过程中，IL-6被快速诱导产生；检测创伤患者的IL-6浓度可以预测更多的手术应激的后期并发症。综上，PCT、IL-6两种炎症指标在不同感染性疾病的诊断和监控中发挥各自特点，在急性感染疾病中联合检测能有效鉴别细菌性感染，PCT在重度感染中与疾病发生发展有重要的提示作用，同时在早期感染中IL-6表现出优异灵敏性。目前，国内PCT、IL-6的检测主要依靠进口试剂，市场上开发的试剂盒多采用酶联免疫和化学发光法，这些方法需要大型分析设备，存在操作过程繁琐，检验周期长，检测成本较高，而且受环境和仪器状态等影响因素较多，易造成测量偏差。CN201810212180.8公开了一种联合检测CRP、PCT、SAA的试剂盒及其制备方法，该试剂盒采用磁微粒免疫层析法，能够一次取样，同时检测CRP、PCT、SAA三个指标，检测快速、定量准确，但是检测材料和磁微粒检测仪器价格较高，不易于市场推广，从而限制了进一步的应用。目前尚缺少可以同时快速、定量准确检测上述两种指标的联检试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种PCT和IL-6联合检测试剂盒及其制备方法。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种PCT和IL-6联合检测试纸条，包括样品垫、结合垫、分析膜、吸收垫和底板，所述分析膜上设有2条检测线和1条质控线，所述样品垫、结合垫、分析膜和吸收垫依次搭接地粘贴在底板上且分别部分重合。其中，2条检测线靠近结合垫一端，质控线靠近吸水垫一端；2条检测线分别为PCT检测线、IL-6检测线；所述PCT检测线包被有PCT检测抗体，所述IL-6检测线包被有IL-6检测抗体；所述结合垫包被有PCT抗体标记荧光微球和IL-6抗体标记荧光微球；所述检测线包被的抗体与所述结合垫包被的抗体分别具有不同的抗原结合位点。本专利技术中，所述样品垫为玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜。所述结合垫为玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜。所述分析膜为硝酸纤维素膜。所述底板的材质为PVC。所用荧光微球是含有荧光物质的聚苯乙烯微球，所述荧光物质选自异硫氰酸荧光素、罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、TO、Cy3、Cy5、藻红蛋白、量子点等中的至少一种。所述荧光微球的粒径为20nm～600nm，发射波长为500nm～700nm(优选525nm～620nm)，荧光微球的使用浓度为0.00001mg/ml～0.1mg/ml；所述荧光微球的表面修饰有官能团，所述官能团选自羧基、氨基或醛基等中的至少一种。所述PCT检测抗体为杭州启泰生物技术有限公司生产的抗体MJG03，所述IL-6检测抗体为MedixBiochemica公司生产的抗体2703。所述PCT抗体标记荧光微球中使用的PCT抗体为杭州启泰生物技术有限公司生产的抗体MJG05，所述IL-6抗体标记荧光微球中使用的IL-6抗体为MedixBiochemica公司生产的抗体2704。所述质控线包被有二抗，所述二抗选自羊抗鼠、羊抗兔、兔抗羊抗体中的至少一种。优选所述二抗为羊抗鼠抗体。所述PCT抗体标记荧光微球是通过EDC和NHS使PCT抗体上N端氨基与荧光微球上的羧基通过化学键连接。所述IL-6抗体标记荧光微球是通过EDC和NHS使IL-6抗体上N端氨基与荧光微球上的羧基通过化学键连接。本专利技术PCT和IL-6联合检测试纸条的长度为5～10cm，宽度为3～5mm。第二方面，本专利技术提供一种PCT和IL-6联合检测试剂盒，所述试剂盒包含上述PCT和IL-6联合检测试纸条，任选包含用于装载所述试纸条的卡壳。第三方面，本专利技术提供PCT和IL-6联合检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：(1)微球活化：向1mg/ml荧光微球1～5ml中加入用50mM，pH6.1MES溶解的0.1～10mgEDC和10mgNHS，活化10～60min，7000～15000rpm离心30min，弃上清，沉淀用pH7.0～8.0的50mMPBS重悬，得到1mg/ml活化的荧光微球溶液。(2)PCT抗体的偶联：将0.5mgPCT标记抗体加入1mg/ml活化的荧光微球溶液2ml中，室温混匀2～4h，10000rpm离心30min，弃上清，沉淀用含5mgBSA的50mMPBS溶液封闭60min，搅拌混匀，10000rpm离心30min，收集的沉淀保存于pH7.8含0.5％BSA的20mMTris缓冲液中，得到浓度为0.1mg/mlPCT抗体标记荧光微球溶液。其中，所述PCT标记抗体为杭州启泰生物技术有限公司生产的抗体MJG05。(3)IL-6抗体的偶联：将0.8mgIL-6标记抗体加入1mg/ml活化的荧光微球溶液2ml中，室温混匀2～4h，10000rpm离心30min，弃上清，沉淀用含1％BSA的50mMPBS溶液封闭60min，搅拌混匀，10000rpm离心30min，收集的沉淀保存于pH7.8含0.5％BSA的20mMTris缓冲液中，得到浓度为0.1mg/mlIL-6抗体标记荧光微球溶液。其中，所述IL-6标记抗体为MedixBiochemica公司生产的抗体2704。(4)将步骤(2)和步骤(3)所得荧光微球溶液按体积比1:0.1～1:10混合。(5)结合垫的制备：以玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜作为结合垫，将步骤(4)制备的荧光微球混合液按0.25～1.5μL/cm喷涂在膜上，干燥备用。(6)分析膜的制备：将PCT检测抗体、IL-6检测抗体和二抗稀释至0.8-1mg/ml，在点膜仪上以0.8-1.2μL/cm的喷量喷涂在硝酸纤维素膜上，形成PCT检测线、IL-6检测线和质控线，即为分析膜，干燥备用。其中，所述PCT检测抗体为杭州启泰生物技术有限公司生产的抗体MJG03，所述IL-6检测抗体为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.PCT和IL‑6联合检测试纸条，其特征在于，包括样品垫、结合垫、分析膜、吸收垫和底板，所述分析膜上设有2条检测线和1条质控线，所述样品垫、结合垫、分析膜和吸收垫依次搭接地粘贴在底板上且分别部分重合；其中，2条检测线靠近结合垫一端，质控线靠近吸水垫一端；2条检测线分别为PCT检测线、IL‑6检测线；所述PCT检测线包被有PCT检测抗体，所述IL‑6检测线包被有IL‑6检测抗体；所述结合垫包被有PCT抗体标记荧光微球和IL‑6抗体标记荧光微球；所述检测线包被的抗体与所述结合垫包被的抗体分别具有不同的抗原结合位点。

【技术特征摘要】
1.PCT和IL-6联合检测试纸条，其特征在于，包括样品垫、结合垫、分析膜、吸收垫和底板，所述分析膜上设有2条检测线和1条质控线，所述样品垫、结合垫、分析膜和吸收垫依次搭接地粘贴在底板上且分别部分重合；其中，2条检测线靠近结合垫一端，质控线靠近吸水垫一端；2条检测线分别为PCT检测线、IL-6检测线；所述PCT检测线包被有PCT检测抗体，所述IL-6检测线包被有IL-6检测抗体；所述结合垫包被有PCT抗体标记荧光微球和IL-6抗体标记荧光微球；所述检测线包被的抗体与所述结合垫包被的抗体分别具有不同的抗原结合位点。2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述样品垫为玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜；和/或所述结合垫为玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜；和/或所述分析膜为硝酸纤维素膜；和/或所述底板的材质为PVC。3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所用荧光微球是含有荧光物质的聚苯乙烯微球，所述荧光物质选自异硫氰酸荧光素、罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、TO、Cy3、Cy5、藻红蛋白、量子点中的至少一种；所述荧光微球的粒径为20nm～600nm，发射波长为500nm～700nm，荧光微球的使用浓度为0.00001mg/ml～0.1mg/ml；所述荧光微球的表面修饰有官能团，所述官能团选自羧基、氨基或醛基中的至少一种。4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述PCT检测抗体为杭州启泰生物技术有限公司生产的抗体MJG03，所述IL-6检测抗体为MedixBiochemica公司生产的抗体2703；所述PCT抗体标记荧光微球中使用的PCT抗体为杭州启泰生物技术有限公司生产的抗体MJG05，所述IL-6抗体标记荧光微球中使用的IL-6抗体为MedixBiochemica公司生产的抗体2704；所述质控线包被有二抗，所述二抗选自羊抗鼠、羊抗兔、兔抗羊抗体中的至少一种。5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述PCT抗体标记荧光微球是通过EDC和NHS使PCT抗体与荧光微球上的官能团连接；和/或所述IL-6抗体标记荧光微球是通过EDC和NHS使IL-6抗体与荧光微球上的官能团连接。6.根据权利要求1-5任一项所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条的长度为5～10cm，宽度为3～5mm。7.PCT和IL-6联合检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-6任一项所述的试纸条，任选包含用于装载所述试纸条的卡壳。8.PCT和IL-6联合检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)微球活化：向1mg/ml荧光微球1～5ml中加入用50mM，pH6.1MES溶解的0.1～10mgEDC和10mgNHS，活化10～60min，7000～15000rpm离心30min，弃上清，沉淀用pH7.0～8.0的50mMPBS重悬，得到1mg/ml活化的荧光微球溶液；其中，所述荧光微球采用权利要求3中所述的荧光微球；(2)PCT抗体的偶联：将0.5mgPCT标记抗体加入1mg/ml活化的荧光微球溶液2ml中，室温混匀2～4h，10000rpm离心30min，弃上清，沉淀用含5mgBSA的50mMPBS溶液封闭60min，搅拌混匀，10000rpm离心30min，收集的沉淀保存于pH7.8含0.5％BSA的20mMTris缓冲液中，得到浓度为0.1mg/mlPCT抗体标记荧光微球溶液；其中，所述PCT标记抗体为杭州启泰生物技术有限公司生产的抗体MJG05；(3)IL-6抗体的偶联：将0.8mgIL-6标记抗体加入1mg/ml活化的荧光微球溶液2ml中，室温混匀2～4h，10000rp...

【专利技术属性】
技术研发人员：张勇，
申请(专利权)人：中生北控生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11