一种用于检测人VEGF蛋白表达水平的体外试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种用于检测人VEGF蛋白表达水平的体外试剂盒，本发明专利技术提供的试剂盒中的人源化单克隆抗体能够很好地、特异性与VEGF抗原结合，具有高效检测VEGF相关疾病的辅助诊断作用。

An in vitro kit for detecting the expression of human vascular endothelial growth factor protein

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测人VEGF蛋白表达水平的体外试剂盒
本专利技术涉及体外检测领域，特别地涉及一种用于检测人VEGF蛋白表达水平的体外试剂盒。
技术介绍
血管内皮生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)，又称血管通透因子(Vascularpermeabilityfactor，VPF)是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。血管内皮生长因子家族有多种亚型，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盘生长因子(PGF)，通常VEGF指VEGF-A。VEGF-A可促进新生血管形成和使血管通透性增加。近日，研究表明血管内皮生长因子(VEGF)在调节正常及异常血管发生中具有关键作用(Ferrara等，Endocr.Rev.18:4-25(1997))，甚至VEGF序列单个等位基因的缺失会导致胚胎致死，表明VEGF在血管系统的发育和分化中具有不可代替的作用。一般肿瘤患者确诊时都到了中晚期，早期筛查并对可疑者或无症状患者及时诊断，可以提高肿瘤患者的生存率，延长生存时间。早发现和早治疗是肿瘤筛查的重要意义。VEGF在肿瘤细胞团向实体肿瘤转化过程中开始大量产生，此时多为肿瘤Tis期、T1期，是肿瘤筛查的最佳时期，并可通过现有的临床手段予以确诊。而其他肿瘤标记物多在肿瘤Ⅲ期、Ⅳ期产生，对早期筛查意义不大。如此，需要开发在动物模型或患者的生物学样品中检测比现有ELISA更高的可测量水平的VEGF，和/或可以测量VEGF的不同同等型的诊断和预后测定法。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种用于检测人VEGF蛋白表达水平的体外试剂盒。本专利技术是以如下技术方案实现的：一种用于检测人VEGF蛋白表达水平的体外试剂盒，将VEGF抗体包被板制成固相抗体，往包被抗体的微孔中依次加入样品，再加入HRP标记的酶标液，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色，TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在终止液作用下转化为黄色，颜色深浅与VEGF抗原含量成正相关，利用酶标仪测定450nm波长下OD，通过标曲计算VEGF含量。进一步地，所述试剂盒包含新型人源化VEGF单抗。进一步地，所述VEGF抗体包括：包含SEQIDNO:07的氨基酸序列的CDR-L1，和/或包含SEQIDNO:08的氨基酸序列的CDR-L2，和/或包含SEQIDNO:09的氨基酸序列的CDR-L3，和/或包含SEQIDNO:10的氨基酸序列的CDR-H1，和/或包含SEQIDNO:11的氨基酸序列的CDR-H2，和/或包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的CDR-H3。进一步地，所述抗体为单克隆抗体，可选地，所述抗体为特异性结合人VEGF的抗体片段，可选地，所述抗体为包含特异性结合人VEGF抗体片段的融合蛋白，可选地，所述抗体为鼠源抗体，可选地，所述抗体为人源化抗体，可选地，所述抗体为鼠源单克隆抗体。优选地，所述抗体为人源化单克隆抗体。9.进一步地，所述抗体包含抗体重链可变区氨基酸序列包括如SEQIDNO:23所示或与SEQIDNO:24的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的VH序列；可选地，所述抗体包含抗体轻链可变区氨基酸序列包括如SEQIDNO:25所示或与SEQIDNO:26的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的VL序列；优选地，所述抗体重链恒定区氨基酸序列如SEQIDNO:23所示，所述抗体轻链恒定区氨基酸序列如SEQIDNO:24所示。进一步地，所述抗体包含选自人抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的任一Fc端的氨基酸序列。进一步地，所述抗体的生产步骤包括：在培养基中和合适的培养条件下培养含有权利要求1-6所述抗体的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收产生的抗体及其抗体片段。进一步地，所述试剂盒还包括酶标包被板、标品、标品缓冲剂、酶标液、样品稀释液、TMB显色剂、洗涤液、终止液。进一步地，所述检测试剂盒可以用于辅助诊断癌症及眼内疾病。进一步地，所述癌症包括但不限于白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、脑肿瘤、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌、黑色素瘤。本专利技术提供的试剂盒中的人源化单克隆抗体能够很好地、特异性与VEGF抗原结合，具有高效检测VEGF相关疾病的辅助诊断作用。具体实施方式定义本专利技术术语“抗体”以最广泛的含义使用，包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、双特异性抗体和抗体片段，只要它们表现出特定的抗原结合活性，本专利技术术语“抗体片段”是指完整抗体以外的分子，其包含结合完整抗体所结合的抗原的完整抗体的一部分，抗体片段包括但不限于Fv、Fab、Fab'、双特异性抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)和/或由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的类别是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五种主要类型的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于免疫球蛋白的不同类别的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。本专利技术术语“IgG”是免疫球蛋白G(ImmunoglobulinG)的缩写。本专利技术术语“人源化”是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部HVR对应于非人抗体的那些HVR，并且全部或基本上全部的FR对应于人抗体的那些FR。人源化抗体任选地可以包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体的结合特异性及亲合力均主要由CDR序列决定，根据成熟、公知的现有各项技术可轻易地将非CDR区域的氨基酸序列改变而获得具有相类似的生物活性的变体。本领域公知，抗原结合功能区是指可以与目标分子如抗原发生特异性相互作用的区域，其作用具有高度选择性，识别一种目标分子的序列通常不能识别其他分子序列。本专利技术术语“结合”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用。除非另有说明，本专利技术所述“结合力”是指结合对成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(KD)表示，亲和力可以通过本领域已知的常用方法来测量。本专利技术术语“同一性”、“相似度”为比对序列并引入间隙以实现最大百分比序列同一性后，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。可以以本领域技术范围内的各种方式实现为了确定百分比氨基酸序列同一性的目的比对，包括但不限于使用公众可用的计算机软件如BLAST、ALIGN或Mega软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。研究表明VEGF是肿瘤和眼内病症有关的新血管形成的关键因子。眼部液体中VEGF浓度与糖尿病性视网本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测人VEGF蛋白表达水平的体外试剂盒，其特征在于，将VEGF抗体包被板制成固相抗体，往包被抗体的微孔中依次加入样品，再加入HRP标记的酶标液，形成抗体‑抗原‑酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色，TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在终止液作用下转化为黄色，颜色深浅与VEGF抗原含量成正相关，利用酶标仪测定450nm波长下OD，通过标曲计算VEGF含量，所述检测试剂盒包含新型人源化VEGF单抗，所述VEGF抗体包括：包含SEQ ID NO:07的氨基酸序列的CDR‑L1，和/或包含SEQ ID NO:08的氨基酸序列的CDR‑L2，和/或包含SEQ ID NO:09的氨基酸序列的CDR‑L3，和/或包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR‑H1，和/或包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR‑H2，和/或包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR‑H3。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测人VEGF蛋白表达水平的体外试剂盒，其特征在于，将VEGF抗体包被板制成固相抗体，往包被抗体的微孔中依次加入样品，再加入HRP标记的酶标液，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色，TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在终止液作用下转化为黄色，颜色深浅与VEGF抗原含量成正相关，利用酶标仪测定450nm波长下OD，通过标曲计算VEGF含量，所述检测试剂盒包含新型人源化VEGF单抗，所述VEGF抗体包括：包含SEQIDNO:07的氨基酸序列的CDR-L1，和/或包含SEQIDNO:08的氨基酸序列的CDR-L2，和/或包含SEQIDNO:09的氨基酸序列的CDR-L3，和/或包含SEQIDNO:10的氨基酸序列的CDR-H1，和/或包含SEQIDNO:11的氨基酸序列的CDR-H2，和/或包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的CDR-H3。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体，可选地，所述抗体为特异性结合人VEGF的抗体片段，可选地，所述抗体为包含特异性结合人VEGF抗体片段的融合蛋白，可选地，所述抗体为鼠源抗体，可选地，所述抗体为人源化抗体，可选地，所述抗体为鼠源单克隆抗体。优选地，所述抗体为人源化单克隆抗体。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体包含抗体重链可变区氨基酸序列包括如SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕鹏辉，
申请(专利权)人：浙江众意生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33