净化黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮免疫吸附剂及免疫亲和柱制造技术

本发明专利技术提供了净化黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮免疫吸附剂及免疫亲和柱及应用。黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体偶联的抗黄曲霉毒素单克隆抗体、抗环匹阿尼酸单克隆抗体、抗赭曲霉毒素A单克隆抗体和抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体，所述的环匹阿尼酸单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201871的杂交瘤细胞株YTT‑2分泌产生的单克隆抗体。本发明专利技术提供的免疫亲和柱可用于同时含有黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮样品的净化‑检测前处理，四种之间无相互干涉影响，性能稳定，进而通过使用本亲和柱建立了一种经济，快捷，精确，安全的高效液相色谱‑质谱联用仪检测方法。

Immunoadsorbent and immunoaffinity column for purification of aflatoxin, cyclopianic acid, ochratoxin A and zearalenone

【技术实现步骤摘要】
净化黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮免疫吸附剂及免疫亲和柱
本专利技术涉及一种净化黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮免疫吸附剂及其免疫亲和柱。
技术介绍
真菌毒素是真菌在生长过程中产生的有毒次级代谢产物，已经发现了300多种结构不同的真菌毒素。真菌能广泛分布于各类农产品与食品中，其中部分菌株能分泌产生真菌毒素，引起人或家畜的急性或慢性真菌中毒症症状，严重威胁人和动物健康。鉴于真菌毒素的危害，世界各国对其含量进行了严格的限定。随着人们对食品安全要求的提高，需要加强农产品中真菌毒素的检测，开发安全、可靠的检测技术，提高我国食品安全水平。黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉等产生的一组结构类似的次生代谢产物，是一组以二吠喃香豆素为基本结构的化合物，广泛存在于粮食谷物和饲料及其加工品中。黄曲霉毒素目前已发现20余种，主要包括黄曲霉毒素B1(AFB1)、B2(AFB2)、AFG和M1(AFM1)等。其中AFB1的毒性最强，它的毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍，世界卫生组织的癌症研究机构将其定Ⅰ类致癌物质。我黄曲霉毒素具有诱导突变、抑制免疫和致癌的作用，主要作用于肝脏，长期食用含有低水平黄曲霉毒素食物的人其肝脏也将受到损害。环匹阿尼酸主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌产生的次生代谢产物，是一种能引起人畜各种损害的天然有毒化合物。环匹阿尼酸化学性质稳定，一般的储存条件和加工过程不能破坏，即使经过巴氏杀菌，也几乎完全不能被破坏。环匹阿尼酸广泛存在于玉米、玉米、花生、饲料等农产品和奶酪等食品中，污染食品及饲料后，会直接或间接进入食物链，威胁人畜的健康和生命安全。因此加强对农产品及食品中环匹阿尼酸的检测、特别是速测，以便及时了解和掌握食品及饲料的卫生信息。赭曲霉毒素是由赭曲霉和纯绿青霉产生的一类真菌毒素，广泛存在于小麦、玉米、花生、玉米等农产品中，其中毒性最大、分布最广、产毒量最高的是赭曲霉毒素A，具有很高的化学稳定性和热稳定性。赭曲霉毒素A具有致畸、致癌、致突变和免疫抑制作用，摄入赭曲霉毒素A后，能导致肝脏与肾脏的毒害，引起肾小管上皮损伤和肠道淋巴腺体坏死，腹泻、厌食和脱水等症状。玉米赤霉烯酮是由镰刀菌产生的真菌毒素，具有免疫毒性、肝毒性、遗传毒性、潜在致癌性、类似雌激素的毒作用，对肿瘤发生也有一定影响，对人和动物的健康有潜在危害。玉米赤霉烯酮具有促进动物生长作用，曾被用于生长促进剂添加于饲料中，促进牲畜的体重增加，随着毒性的研究，已禁止将其作为生长促进剂。玉米赤霉烯酮广泛存在于玉米、高粱、小麦等农作物及奶中，并通过污染的农产品，进入动物和人体内,给畜牧业和人类健康造成威胁。目前，现有环匹阿尼酸检测方法包括薄层层析法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等。其中薄层层析法不需要特殊的仪器设备，但不能准确定量，且对实验人员和周围环境污染危害较大。高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等精密仪器分析法灵敏度高，准确性好，样品前处理过程繁琐。免疫亲和色谱柱是一种新型的样本前处理技术，它是将免疫反应与色谱分析方法相结合，利用抗原抗体结合的高度特异性和亲和力，用化学偶联键合方法将特异性抗体结合到层析吸附剂上，基于免疫学可逆结合来实现对复杂样品中目标物质的效的分离和富集净化。目前，尚未见有净化黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮免疫吸附剂及免疫亲和柱的相关报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种净化黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮免疫吸附剂、复合亲和柱及应用。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮免疫吸附剂，所述的免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体上偶联的黄曲霉毒素单克隆抗体、环匹阿尼酸单克隆抗体、赭曲霉毒素A单克隆抗体和玉米赤霉烯酮单克隆抗体，所述抗环匹阿尼酸单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO.C201871的杂交瘤细胞株YTT-2分泌产生。按上述方案，所述固相载体为琼脂糖凝胶。按上述方案，所述抗黄曲霉毒素单克隆抗体为黄曲霉毒素通用单克隆抗体，由保藏编号为CCTCCNO.C201013的杂交瘤细胞株1C11分泌产生，，抗赭曲霉毒素A单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO.C201329的杂交瘤细胞株1H2分泌产生，抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO.C201328的杂交瘤细胞株2D3分泌产生。装载有黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮免疫吸附剂的净化黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮复合亲和柱。净化黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮复合亲和柱的制备，包括：a)固相载体基质处理将CNBr活化的琼脂糖凝胶基质粉末在pH2-3的条件下用HCl洗涤除杂；CNBr活化的琼脂糖凝胶是以冻干形式提供。b)配体偶联使用偶联缓冲液溶解待偶联的黄曲霉毒素单克隆抗体、环匹阿尼酸单克隆抗体、赭曲霉毒素A单克隆抗体和玉米赤霉烯酮单克隆抗体，获得各抗体溶液，迅速将步骤a)活化的琼脂糖凝胶基质转移到所述抗体溶液中，进行偶联；c)配体封闭封闭所有残留的活性基团；d)除去偶联后未偶联上的多余的配体；e)装柱。按上述方案，所述步骤a)中洗涤用HCl浓度为1mmol/L，洗涤时间为15min。按上述方案，步骤b)中的偶联缓冲液为0.2mol/LNaHCO3，pH8.3，每个抗体溶液浓度为10-15mg/mL。按上述方案，步骤b)中的偶联条件为：室温条件(20-25℃)下充分混匀上述混和物2-4h。按上述方案，步骤c)的配体封闭过程为：转移经步骤b)处理的琼脂糖凝胶基质至0.1mol/LTris-HCl缓冲液中，室温条件下静置2-4h。按上述方案，步骤d)为：依次用pH值为4和pH值为8的缓冲液对经步骤c)处理后的琼脂糖凝胶基质进行洗涤，至少洗涤3个循环；pH值为4和pH值为8的缓冲液分别可选0.1mol/L醋酸/醋酸钠缓冲液和0.1mol/LTris-HCl缓冲液。按上述方案，步骤d)处理后用5倍琼脂糖凝胶体积的0.01％NaN3-PBS洗涤，并使用0.01％NaN3-PBS保存，然后装柱。在此基础上本专利技术建立了免疫亲和柱净化高效液相色谱-质谱联用仪法检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮含量的方法，当含有黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的样品通过免疫亲和柱时，免疫吸附剂会特异性的吸附黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮，其他的杂质则流出免疫亲和柱，然后用色谱级甲醇洗脱亲和柱，洗脱流速1mL/min～2mL/min，将黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮从柱子中洗脱下来，样品即得到了很好的净化，由此收集的洗脱液供高效液相色谱-质谱联用仪检测用。基于上述复合亲和柱检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮含量的方法，将含有黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的样品通过免疫亲和柱时，免疫吸附剂会特异性的吸附黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮，其他的杂质则流出免疫亲和柱，然后用色谱级甲醇洗脱亲和柱，收集洗脱液即净化浓缩后的样品供高效液相色谱-质谱联用仪检测，得多各毒素含量。具体实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮免疫吸附剂，其特征在于：所述的免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体上偶联的抗黄曲霉毒素单克隆抗体、抗环匹阿尼酸单克隆抗体、抗赭曲霉毒素A单克隆抗体和抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体，所述的抗环匹阿尼酸单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201871的杂交瘤细胞株YTT‑2分泌产生。

【技术特征摘要】
1.黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮免疫吸附剂，其特征在于：所述的免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体上偶联的抗黄曲霉毒素单克隆抗体、抗环匹阿尼酸单克隆抗体、抗赭曲霉毒素A单克隆抗体和抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体，所述的抗环匹阿尼酸单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO.C201871的杂交瘤细胞株YTT-2分泌产生。2.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮免疫吸附剂，其特征在于：所述的抗黄曲霉毒素单克隆抗体为抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体，由保藏编号为CCTCCNO.C201013的杂交瘤细胞株1C11分泌产生；所述的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO.C201329的杂交瘤细胞株1H2分泌产生；所述的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO.C201328的杂交瘤细胞株2D3分泌产生。3.装载有权利要求1所述的黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮免疫吸附剂的净化黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮复合亲和柱。4.权利要求3所述的净化黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮复合亲和柱的制备，其特征在于：包括以下步骤：a)固相载体基质处理将CNBr活化的琼脂糖凝胶基质粉末在pH2-3的条件下用HCl洗涤除杂；b)配体偶联使用偶联缓冲液溶解待偶联的抗黄曲霉毒素单克隆抗体、抗环匹阿尼酸单克隆抗体、抗赭曲霉毒素A单克隆抗体和抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体，获得各抗体溶液，迅速将步骤a)活化的琼脂糖凝胶基质转移到所述抗体溶液中，进行偶联；c)配体封闭封闭所有残留的活性基团；d)除去偶联后未偶联上的多余的配体；e)装柱。5.根据权利要求4所述的净化黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮复合亲和柱的制备，其特征在于：所述步骤a)中洗涤用HCl浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：李培武，张奇，白艺珍，李慧，张文，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42