一种基于HRM技术的马尾松SNP基因分型方法技术

本发明专利技术公开了一种基于HRM技术的马尾松SNP基因分型方法，属于基因工程技术领域，筛选10个SNP位点并设计对应引物，提取马尾松基因组DNA，进行PCR反应和HRM分析，收集数据，对每个样品进行SNP位点基因型分析，并利用上述方法构建马尾松样本的SNP指纹图谱。本发明专利技术操作简便快速，使用成本低，结果准确，可用于分子标记辅助育种，遗传资源多样性研究。

A SNP Genotyping Method of Pinus massoniana Based on HRM Technology

【技术实现步骤摘要】
一种基于HRM技术的马尾松SNP基因分型方法
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种基于HRM技术的马尾松SNP基因分型方法。
技术介绍
马尾松是我国重要的优质用材树种之一，其经济价值高、用途广，在森林资源发展、松香林产业化及森林生态服务功能中占据重要地位。随着科学技术手段的发展和科学研究的由浅入深，对与马尾松的研究已经从传统的形态学领域和应用领域深入到了分子生物领域。SNP(singlenucleotidepolymorphism)是生物体中最丰富的遗传变异形式，目前根据自动化程度的高低，大致将SNP的检测方法分为两大类，即基于凝胶电泳的SNP检测方法和高通量、自动化的SNP检测方法。基于凝胶电泳的SNP检测方法包括变性梯度凝胶电泳(DDGE)、单链构象多态性(SSCP)、酶切扩增多态性序列(CAPS)、等位基因特异性PCR(AS-PCR)。这些传统方法技术简便，成本很低，但是所需的时间长、灵敏度有限、稳定性差，难以开展大规模的工作。而且，以凝胶电泳为基础的传统方法，DNA链二级结构的判断容易造成假阳性或假阴性。自动化、高通量检测SNP的技术包括直接测序、DNA芯片、变性高效液相色谱(DHPLC)、质谱检测技术、高分辨率熔解曲线(HRM)等。与基于凝胶电泳的SNP检测方法相比，此类方法可实现SNP高通量、自动化检测，准确性有很大提高，但也存在成本较高的问题。高分辨熔解曲线(high-resolutionmelt，HRM)分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。它是一种高效稳健的PCR技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、配型等的分析。因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM技术受到普遍关注。目前，SNP检测已应用于松、杨、黄杉、桉和云杉等属的多个树种的遗传育种学研究。为其分子标记辅助选择、改良木材材质、缩短育种周期及揭示林木群体进化规律及其生态学意义奠定了基础。而目前关于马尾松的快速、准确的SNP基因分型的研究，鲜见报道。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种基于HRM技术的马尾松SNP基因分型方法，操作简便，无需序列特异性探针以及后续测序，只需要设计PCR引物，进行PCR反应，接着直接进行HRM，便可完成对样品的基因型分析，特异性好，完全闭管操作。本专利技术的另一目的是提供上述方法在构建马尾松样本的SNP指纹图谱中的应用。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种基于HRM技术的马尾松SNP基因分型方法，包括以下步骤：1)马尾松SNP位点筛选；2)根据筛选的SNP位点，设计对应引物，各引物的核苷酸序列分别为：SNP-1上游引物：5′-ACGGCATCCCTGTAATACCT-3′；SNP-1下游引物：5′-GTGTGGAAGGATAGGGTAAG-3′；SNP-2上游引物：5′-CAGAGCTGGCGATGATGTC-3′；SNP-2下游引物：5′-GAATCGCTCACACTCTCAGA-3′；SNP-3上游引物：5′-GAGAGTAGAGCAAGTAGACAT-3′；SNP-3下游引物：5′-AACACCCATTCGTCTCAGAG-3′；SNP-4上游引物：5′-CGAAACAGTGGCATTACAGG-3′；SNP-4下游引物：5′-AAAGGGTGGTCTCTGTCGG-3′；SNP-5上游引物：5′-GACATCAAGCCATTTCCTCAA-3′；SNP-5下游引物：5′-GTGATACAAAAGGAACTGGGA-3′；SNP-6上游引物：5′-CAGCACAGCCCGAACACTT-3′；SNP-6下游引物：5′-GAGATGTCATAGGAGAAGTAG-3′；SNP-7上游引物：5′-AAGAGCCAGCATCCACGGA-3′；SNP-7下游引物：5′-GCGGTTCATTATCTGTTGCC-3′；SNP-8上游引物：5′-TCGTATGCGGTGCTTTCTGA-3′；SNP-8下游引物：5′-GAGTTGTTAGAAGCCTTGGG-3′；SNP-9上游引物：5′-TCGCACATCAGAGTCACTTG-3′；SNP-9下游引物：5′-TGGTTTCAAAGCACTGGATAC-3′；SNP-10上游引物：5′-CAGGTTGGGATGATAAGAGAT-3′；SNP-10下游引物：5′-GGGTTCAGTTCAGTGTATCTA-3′；3)马尾松基因组DNA提取；4)马尾松基因组DNA进行PCR反应和HRM分析；5)SNP基因分型验证。步骤1)中马尾松SNP位点的筛选为：根据马尾松分化木质部及其原生质体的转录组测序结果进行SNP位点预测，对所获得的SNP预测位点进行筛选，预测的SNP位点在马尾松分化木质部及其原生质体的样本中表现出不同的碱基突变类型，且突变位点前后100bp范围内不存在其他SNP预测位点。基于HRM技术的马尾松SNP基因分型方法在构建马尾松样本的SNP指纹图谱中的应用：获得27份马尾松DNA样本对应的指纹图谱，分别为：DNA样本1指纹代码：154455；DNA样本2指纹代码：534154；DNA样本3指纹代码：534555；DNA样本4指纹代码：135434；DNA样本5指纹代码：134554；DNA样本6指纹代码：134134；DNA样本7指纹代码：135154；DNA样本8指纹代码：154154；DNA样本9指纹代码：124544；DNA样本10指纹代码：125134；DNA样本11指纹代码：424142；DNA样本12指纹代码：425554；DNA样本13指纹代码：125554；DNA样本14指纹代码：425134；DNA样本15指纹代码：124554；DNA样本16指纹代码：124154；DNA样本17指纹代码：125154；DNA样本18指纹代码：424554；DNA样本19指纹代码：124134；DNA样本20指纹代码：425144；DNA样本21指纹代码：124542；DNA样本22指纹代码：125132；DNA样本23指纹代码：154142；DNA样本24指纹代码：124132；DNA样本25指纹代码：134152；DNA样本26指纹代码：424532；DNA样本27指纹代码：124135。步骤1)中筛选到的SNP位点如下：SNP-1：等位基因突变位点为：A/G；SNP-2：等位基因突变位点为：C/A；SNP-3：等位基因突变位点为：G/T；SNP-4：等位基因突变位点为：C/T；SNP-5：等位基因突变位点为：A/C；SNP-6：等位基因突变位点为：C/T；SNP-7：等位基因突变位点为：C/T；SNP-8：等位基因突变位点为：G/A；SNP-9：等位基因突变位点为：G/C；SNP-10：等位基因突变位点为：G/A。步骤4)中PCR反应体系为：Forget-Me-NotTMMix5μL，0.25μM上下游引物各1μL，30ngDNA1μL，ddH2O2μL，总体积10μL。步骤4)中PCR反应程序为：60℃2mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于HRM技术的马尾松SNP基因分型方法，其特征在于，包括以下步骤：1)马尾松SNP位点筛选；2)根据筛选的SNP位点，设计对应引物，各引物的核苷酸序列分别为：SNP‑1上游引物：5′‑ACGGCATCCCTGTAATACCT‑3′；SNP‑1下游引物：5′‑GTGTGGAAGGATAGGGTAAG‑3′；SNP‑2上游引物：5′‑CAGAGCTGGCGATGATGTC‑3′；SNP‑2下游引物：5′‑GAATCGCTCACACTCTCAGA‑3′；SNP‑3上游引物：5′‑GAGAGTAGAGCAAGTAGACAT‑3′；SNP‑3下游引物：5′‑AACACCCATTCGTCTCAGAG‑3′；SNP‑4上游引物：5′‑CGAAACAGTGGCATTACAGG‑3′；SNP‑4下游引物：5′‑AAAGGGTGGTCTCTGTCGG‑3′；SNP‑5上游引物：5′‑GACATCAAGCCATTTCCTCAA‑3′；SNP‑5下游引物：5′‑GTGATACAAAAGGAACTGGGA‑3′；SNP‑6上游引物：5′‑CAGCACAGCCCGAACACTT‑3′；SNP‑6下游引物：5′‑GAGATGTCATAGGAGAAGTAG‑3′；SNP‑7上游引物：5′‑AAGAGCCAGCATCCACGGA‑3′；SNP‑7下游引物：5′‑GCGGTTCATTATCTGTTGCC‑3′；SNP‑8上游引物：5′‑TCGTATGCGGTGCTTTCTGA‑3′；SNP‑8下游引物：5′‑GAGTTGTTAGAAGCCTTGGG‑3′；SNP‑9上游引物：5′‑TCGCACATCAGAGTCACTTG‑3′；SNP‑9下游引物：5′‑TGGTTTCAAAGCACTGGATAC‑3′；SNP‑10上游引物：5′‑CAGGTTGGGATGATAAGAGAT‑3′；SNP‑10下游引物：5′‑GGGTTCAGTTCAGTGTATCTA‑3′；3)马尾松基因组DNA提取；4)马尾松基因组DNA进行PCR反应和HRM分析；5)SNP基因分型验证。...

【技术特征摘要】
1.一种基于HRM技术的马尾松SNP基因分型方法，其特征在于，包括以下步骤：1)马尾松SNP位点筛选；2)根据筛选的SNP位点，设计对应引物，各引物的核苷酸序列分别为：SNP-1上游引物：5′-ACGGCATCCCTGTAATACCT-3′；SNP-1下游引物：5′-GTGTGGAAGGATAGGGTAAG-3′；SNP-2上游引物：5′-CAGAGCTGGCGATGATGTC-3′；SNP-2下游引物：5′-GAATCGCTCACACTCTCAGA-3′；SNP-3上游引物：5′-GAGAGTAGAGCAAGTAGACAT-3′；SNP-3下游引物：5′-AACACCCATTCGTCTCAGAG-3′；SNP-4上游引物：5′-CGAAACAGTGGCATTACAGG-3′；SNP-4下游引物：5′-AAAGGGTGGTCTCTGTCGG-3′；SNP-5上游引物：5′-GACATCAAGCCATTTCCTCAA-3′；SNP-5下游引物：5′-GTGATACAAAAGGAACTGGGA-3′；SNP-6上游引物：5′-CAGCACAGCCCGAACACTT-3′；SNP-6下游引物：5′-GAGATGTCATAGGAGAAGTAG-3′；SNP-7上游引物：5′-AAGAGCCAGCATCCACGGA-3′；SNP-7下游引物：5′-GCGGTTCATTATCTGTTGCC-3′；SNP-8上游引物：5′-TCGTATGCGGTGCTTTCTGA-3′；SNP-8下游引物：5′-GAGTTGTTAGAAGCCTTGGG-3′；SNP-9上游引物：5′-TCGCACATCAGAGTCACTTG-3′；SNP-9下游引物：5′-TGGTTTCAAAGCACTGGATAC-3′；SNP-10上游引物：5′-CAGGTTGGGATGATAAGAGAT-3′；SNP-10下游引物：5′-GGGTTCAGTTCAGTGTATCTA-3′；3)马尾松基因组DNA提取；4)马尾松基因组DNA进行PCR反应和HRM分析；5)SNP基因分型验证。2.权利要求1所述的基于HRM技术的马尾松SNP基因分型方法在构建马尾松样本的SNP指纹图谱中的应用：获得27份马尾松DNA样本对应的指纹图谱，分别为：DNA样本1指纹代码：154455；DNA样本2指纹代码：534154；DNA样本3指纹代码：534555；DNA样本4指纹代码：135434；DNA样本5指纹代码：134554；DNA样本6指纹代码：134134；DNA样本7指纹代码：135154；DNA样本8指纹代码：154154；DNA样本9指纹代码：124544；DNA样本10指纹代码：125134；DNA样...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥猛，祁浩然，沈海伦，徐梦璇，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32