一种铜绿假单胞菌显色培养基及利用其快速检测的方法技术

本发明专利技术公开了一种铜绿假单胞菌显色培养基及利用其快速检测的方法，涉及铜绿假单胞菌检测技术领域，本发明专利技术所述的铜绿假单胞菌显色培养基包括基础培养基、显色底物、抑菌剂，显色底物包括2,3,5‑苯基氯化四氮唑、4‑甲基伞形酮‑D‑葡萄糖醛酸苷，抑菌剂包括萘啶酮酸、环丝氨酸、牛胆盐，2,3,5‑苯基氯化四氮唑可以和铜绿假单胞菌代谢产物作用显红色，4‑甲基伞形酮‑D‑葡萄糖醛酸苷和铜绿假单胞菌作用在366nm紫外灯下显荧光；2,3,5‑苯基氯化四氮唑和抑菌剂共同配合能够抑制常见的干扰菌的生长，避免出现假阳性的情况，本发明专利技术所述铜绿假单胞菌快速检测的方法，仅需24h即可对铜绿假单胞菌检测计数，省时省力，稳定可靠，灵敏性更佳。

A Chromogenic Culture Medium for Pseudomonas aeruginosa and Its Rapid Detection Method

【技术实现步骤摘要】
一种铜绿假单胞菌显色培养基及利用其快速检测的方法
本专利技术涉及铜绿假单胞菌检测
，更具体的说，它涉及一种铜绿假单胞菌显色培养基及利用其快速检测的方法。
技术介绍
铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)属于假单胞菌属，普遍分布于自然界中，可以在水中生存时间很长，，被认为是一种水源性条件致病菌；铜绿假单胞菌可引起正常人腹泻等疾病，患代谢疾病、血液病和恶性肿瘤的病人，以及术后或某些治疗后的患者易感染本菌；本菌经常引起术后伤口感染，也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等，本菌引起的感染病灶可导致血行散播，而发生菌血症和败血症，烧伤后感染了铜绿色假单胞菌可造成死亡，是危害人类健康的一大威胁。世界卫生组织和我国将此菌都作为瓶装饮用水的污染危害指示菌，日本和加拿大等国家已经对水中的铜绿假单胞菌的存在做出了限量规定；国际食品法典委员会(CAC)和欧盟成员国都明确作出了相应的规定，并指出在水中不得检测出此菌。根据我国GB8537-2018食品安全国家标准中，关于微生物限量标准一项，其中铜绿假单胞菌(单位：CFU/250mL)，标准值为n＝5c＝0m＝0，即5份样品中，各取250mL检测，5份样品中铜绿假单胞菌检测值必须全部为0CFU，意为5份水样检测中铜绿假单胞菌菌落数量均为0，允许出现特例的水样数量为0，才为合格。GB8538-2016食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法中给出一种铜绿假单胞菌的检测方法，需要先对水样进行过滤，然后将过滤后的滤膜平铺在已制备好的CN琼脂平板上，将平板倒置于36℃±1℃培养24h～48h，在培养20h～24h和40h～48h后观察滤膜上菌落的生长情况并计数，如果菌落全部呈现蓝绿色即判定为铜绿假单胞菌检测结果为阳性，但这种情况比较少出现；在实际操作过程中，如果出现产荧光(非蓝/绿色)菌落时，需要对这种菌落进行产氨试验，产氨试验检测结果为阳性即判定为检出铜绿假单胞菌；实际操作过程中，如果出现红褐色菌落时，需要对这种菌落进行产氨试验、氧化酶试验、荧光试验，当检测结果均呈阳性的时候即判定为检出铜绿假单胞菌。水样中可能存在铜绿假单胞菌或其他干扰干扰菌，因此使用上述方法对水样进行过滤培养24h～48h后，通常会产生干扰菌落，即出现产荧光(非蓝/绿色)菌落或红褐色菌落，此时至少需要额外的1-5天做进一步的生化实验，以确定这些菌落是否为铜绿假单胞菌，综合的检测时间需要约5-7天，非常的耗时费力；并且在培养后铜绿假单胞菌和其他干扰干扰菌的菌落需要用专业的实验员肉眼对菌落的颜色和形态进行判断，菌落过分生长有可能出现菌落融合，非常考验实验员的工作经验是否丰富，而当铜绿假单胞菌发生变异时，菌落形态和颜色发生改变，难以从菌落颜色和形态上进行判断，容易造成漏判、误判。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种铜绿假单胞菌显色培养基，其通过在铜绿假单胞菌培养基中加入铜绿假单胞菌特异性显色酶底物，由于食品、水源中是禁止检出铜绿假单胞菌的，水源中存假铜绿假单胞菌的情况下，能够在24小时内在显色培养基中显色呈阳性检出并计数。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种铜绿假单胞菌显色培养基，包括基础培养基、显色底物、抑菌剂，所述显色底物包括2,3,5-苯基氯化四氮唑；所述抑菌剂包括萘啶酮酸；所述基础培养基包括碳源、氮源、无机盐、生长因子、水。通过采用上述技术方案，基础培养基给铜绿假单胞菌和其他干扰菌提供最基本的生长条件；如果待测样品中存在铜绿假单胞菌，铜绿假单胞菌产生脱氢酶与显色底物2,3,5-苯基氯化四氮唑发生脱氢酶作用，产生红色的脂溶性三苯基甲月替，不溶于水显红色；研究发现2,3,5-苯基氯化四氮唑也具有一定抑制干扰菌的作用；抑菌剂萘啶酮酸用于抑制其他干扰菌，避免干扰菌干扰显色计数。本专利技术进一步设置为：所述显色底物2,3,5-苯基氯化四氮唑的用量为0.1-1.0g/L。通过采用上述技术方案，显色底物2,3,5-苯基氯化四氮唑添加量在0.1-1.0g/L范围内时都足够使铜绿假单胞菌菌落达到预期显色效果。本专利技术进一步设置为：显色底物2,3,5-苯基氯化四氮唑用量为0.5g/L。通过采用上述技术方案，铜绿假单胞菌菌落生长状况良好，菌落形态佳，显色效果好，对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等干扰干扰菌具有更加良好的抑制效果，因此0.5g/L为显色底物2,3,5-苯基氯化四氮唑在铜绿假单胞菌显色培养基中的最佳添加量。本专利技术进一步设置为：所述抑菌剂萘啶酮酸的用量为0.01-0.03g/L。通过采用上述技术方案，抑菌剂萘啶酮酸添加量在0.01-0.03g/L范围内时，干扰干扰菌均能够受到抑制。本专利技术进一步设置为：抑菌剂萘啶酮酸的用量为0.015g/L。通过采用上述技术方案，铜绿假单胞菌菌落生长状况更加良好，菌落形态佳，显色效果好，铜绿假单胞菌菌落不会受到抑制，培养基上基本不生长干扰干扰菌。本专利技术进一步设置为：所述显色底物还包括4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷。通过采用上述技术方案，显色底物4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷可以与铜绿假单胞菌作用，在366nm紫外灯下有荧光，个别可以显荧光的干扰菌受到抑菌剂和2,3,5-苯基氯化四氮唑的抑制无法在铜绿假单胞菌显色培养基上生长，显色底物4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷和显色底物2,3,5-苯基氯化四氮唑配合，铜绿假单胞菌显色培养基上生长的铜绿假单胞菌的菌落显红色且在366nm紫外灯下有荧光，可以更加准确的判定检出铜绿假单胞菌，结果准确可靠，清楚明显。本专利技术进一步设置为：所述4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷的用量为0-0.1g/L。通过采用上述技术方案，显色底物4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷可以与铜绿假单胞菌发生作用，菌落在366nm紫外灯下有荧光。本专利技术进一步设置为：显色底物4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷的用量为0.01g/L。通过采用上述技术方案，铜绿假单胞菌菌落显荧光效果好，铜绿假单胞菌菌落不会受到抑制，培养基上未检测出不生长干扰干扰菌。本专利技术进一步设置为：所述碳源的用量为0-40g/L，所述碳源由葡萄糖提供；所述氮源的用量为5-25g/L，所述氮源由蛋白胨和/或酪蛋白提供；所述生长因子由酵母浸膏提供，所述酵母浸膏的用量为2-14g/L；所述无机盐包括硫酸钾、氯化镁，所述硫酸钾的用量为5-20g/L，所述氯化镁的用量为1-3g/L；余量为蒸馏水。通过采用上述技术方案，所述碳源由主要葡萄糖提供，葡萄糖为铜绿假单胞菌提供碳源，由于铜绿假单胞菌对营养要求不高，可以不添加葡萄糖；蛋白胨和/或酪蛋白为铜绿假单胞菌的生长提供氮源，维持培养液的电解质平衡；酵母浸膏为菌种提供营养、维生素、碱基、嘌呤、嘧啶等微生物生长所必须的生长因子，以促进铜绿假单胞菌的生长；在培养基中添加硫酸钾、氯化镁为铜绿假单胞菌生长提供微量元素，维持培养液中的渗透压；本专利技术进一步设置为：所述蛋白胨的用量为15.0g/L；所述酵母浸膏的用量为8.0g/L；所述硫酸钾的用量为10.0g/L，所述氯化镁的用量为1.4g/L；所述琼脂的用量为15.0g/L；余量为蒸馏水。通过采用上述技术方案，以此配方用量配制而成的基础培养基的性能更加适于铜绿假单胞菌生长。本专利技术进一步设置为：所述抑菌剂还包括有环丝氨酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种铜绿假单胞菌显色培养基，其特征在于，包括基础培养基、显色底物、抑菌剂，所述显色底物包括2,3,5‑苯基氯化四氮唑；所述抑菌剂包括萘啶酮酸；所述基础培养基包括碳源、氮源、无机盐、生长因子、水。

【技术特征摘要】
1.一种铜绿假单胞菌显色培养基，其特征在于，包括基础培养基、显色底物、抑菌剂，所述显色底物包括2,3,5-苯基氯化四氮唑；所述抑菌剂包括萘啶酮酸；所述基础培养基包括碳源、氮源、无机盐、生长因子、水。2.根据权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌显色培养基，其特征在于，所述显色底物2,3,5-苯基氯化四氮唑的用量为0.1-1.0g/L。3.根据权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌显色培养基，其特征在于，所述抑菌剂萘啶酮酸的用量为0.01-0.03g/L。4.根据权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌显色培养基，其特征在于，所述显色底物还包括4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷。5.根据权利要求4所述的一种铜绿假单胞菌显色培养基，其特征在于，所述4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷的用量为0-0.1g/L。6.根据权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌显色培养基，其特征在于，所述碳源的用量为0-40g/L，所述碳源由葡萄糖提供；所述氮源的用量为5-25g/L，所述氮源由蛋白胨和/或酪蛋白提供；所述生长因子由酵母浸膏提供，所述酵母浸膏的用量为2-14g/L；所述无机盐包括硫酸钾、氯化镁，所述硫酸钾的用量为5-20g/L，所述氯化镁的用量为1-3g/L；余量为蒸馏水。7.根据权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌显色培养基，其特征在于，所述抑菌剂还包括有环丝氨酸、牛胆盐中的一种或多种；所述牛胆盐的用量为0-1.0g/L；所述环丝氨酸的用量为0-1.0g/L。8.一种铜绿假单胞菌快速检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤A、配制权利要求书1-7中任意一种铜绿假单胞菌显色培养基；步骤B、对待测水源混匀并取样250mL后得到待测样品；步骤C、对待测样品进行梯度稀释后得到梯度稀释待测样品；步骤D、用无菌镊子夹取灭菌过滤膜边缘部分,粗糙面向上贴放在已灭菌的滤床上,...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋曙光，薛亮，曹琥靓，陈李帆，张晨俍，陈昌经，
申请(专利权)人：上海源本食品质量检验有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31