低温诱导位点特异性重组删除的无标记转化方法技术

本发明专利技术公开了一种低温诱导位点特异性重组删除的无标记转化方法，该方法首先构建低温诱导WCS120启动子驱动的ParA/MRS位点特异性重组系统植物表达载体；通过农杆菌转化法转化小麦，筛选获得转基因植株；然后进行转基因后代标记基因删除检测和抗旱性检测，建立小麦无选择标记基因转化体系，获得无选择标记基因转化植株。对小麦基因工程遗传改良有非常重要意义。

Label-free transformation for site-specific recombination deletion induced by low temperature

【技术实现步骤摘要】
低温诱导位点特异性重组删除的无标记转化方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种低温诱导位点特异性重组删除的无标记转化方法，以用于小麦的遗传转化改良。
技术介绍
在植物遗传转化中，为了从大量非转化细胞中获得转化体，选择标记基因起着非常重要的作用。目前使用较多的选择标记基因大多数是抗生素或除草剂抗性基因。随着越来越多的转基因植物进人环境释放或商品化种植，转基因作物的安全性及其商业化问题在国内、国际争议日益激烈，争议的焦点就是转基因作物中选择标记基因对生态环境和食品安全方面的风险。因此，有效地剔除选择基因已成为作物基因工程改良的关键。位点特异性重组可精确地删除选择标记基因，同时可获得单拷贝转基因植株，有利于转入基因的表达和稳定性，在转基因研究中有着巨大的应用前景(Srivastavaetal.,1999)。近年来，位点特异性重组系统已被成功地应用于部分单子叶植物如玉米(Zhangetal.,2003；Kerbachetal.,2005；Lietal.,2010)和水稻(Senguptaetal.，2010；Akbudaketal.，2011)选择标记基因的删除。美国孟山都公司利用Cre/Loxp系统获得的无选择标记基因的高赖氨酸转基因玉米品种已商品化(Ow，2007)。新的单向重组系统也逐渐被证实可用于植物位点特异性重组。这一系统在完成删除后不能催化整合，因此更加稳定，如CinH/RS重组系统(Kholodiietal.，2001)和ParA/MRS系统(Thomsonetal.，2009)。小麦是我国大面积种植的主要粮食作物之一，且在大多数情况下是直接食用的主粮，因此其安全的无标记基因转化体系的建立就尤为关键。然而，小麦位点特异性重组方面的研究相对滞后，目前仅有两个研究小组的4篇研究报道(Srivastavaetal.，1999；Srivastava1andOw，2003；Rubtsovaetal.，2008；Kempeetal.，2010)。在双子叶植物上成功使用的化学诱导和热激诱导删除系统，化学处理和高温诱导会降低小麦愈伤组织的分化，从而降低转化率，对于再生率相对较低的小麦愈伤组织来说，应用有一定的局限性。以下是专利技术人给出的参考文献：1)AkbudakMAandSrivastavaV.ImprovedFLPrecombinase,FLPe,efficientlyremovesmarkergenefromtransgenelocusdevelopedbyCre–loxmediatedsite-specificgeneintegrationinrice.MolBiotechnol，2011，DOI10.1007/s12033-011-9381-y(online)。2)KempeK,RubtsovaM,BergerC,KumlehnJ,SchollmeierC,andGilsM.TransgeneexcisionfromwheatchromosomesbyphagephiC31Integrase.PlantMolBiol，2010，72(6):673-687。3)KerbachS,LorzHandBeckerD.Site-specificrecombinationinZeamays.TheorApplGenet，2005，111:1608–1616。4)KholodiiG.2001.Theshufflingfunctionofresolvases[J].Gene,269:121-130。5)LiB,LiN,DuanX,WeiA,YangAandZhangJ.Generationofmarker-freetransgenicmaizewithimprovedsalttoleranceusingtheFLP/FRTrecombinationsystem.JournalofBiotechnology,2010，145:206-213。6)OwDW.GMmaizefromsite-specificrecombinationtechnology,whatnext？[J].CurrOpinBiotech，2007，18:115-120。7)RubtsovaM,KempeK,GilsA,IsmagulA,WeyenJandGilsM.ExpressionofactiveStreptomycesphagephiC31integraseintransgenicwheatplants.PlantCellRep，2008，27:1821-1831。8)SenguptaS,ChakrabortiD,MondalHAandDasS.Selectableantibioticresistancemarkergene-freetransgenicriceharbouringthegarlicleaflectingeneexhibitsresistancetosap-suckingplanthoppers.PlantCellRep，2010，29:261-271。9)SrivastavaV,AndersonODandOWDW.Single-copytransgenicwheatgeneratedthroughtheresolutionofcomplexintegrationpatterns[J].ProcNatlAcadSci，1999，96:11117-11121。10)Srivastava1VandOwD.RareinstancesofCre-mediateddeletionproductmaintainedintransgenic.PlantMolBio，2003，52(3):661-668。11)ThomsonJG,YauYY,BlanvillainR,ChiniquyD,ThilmonyRandOwDW.ParAresolvasecatalyzessite-specificexcisionofDNAfromtheArabidopsisgenome[J].TransgenicRes，2009，18:237-248。12)ZhangW,SubbaraoS,AddaeP,ShenA,ArmstrongC,PeschkeVandGilbertsonL.Cre/loxmediatedmarkergeneexcisionintransgenicmaize(ZeamaysL.)plants.TheorApplGenet，2003，107:1157-1168。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种利用位点特异性重组系统建立小麦低温诱导删除选择标记基因的无标记转化体系的方法。为了实现上述任务，本专利技术采取如下的技术解决方案：一种利用位点特异性重组系统建立小麦低温诱导删除选择标记基因的无标记转化体系的方法，其特征在于，该方法首先构建低温诱导WCS120启动子驱动的ParA/MRS位点特异性重组系统植物表达载体；通过农杆菌转化法转化小麦，筛选获得转基因植株；然后进行转基因后代标记基因删除检测和抗旱性检测，建立小麦无选择标记基因转化体系，获得无选择标记基因转化植株。其具体的步骤是：步骤1)：低温诱导删除中间载体pXL5523-fwcs的构建本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种低温诱导位点特异性重组删除的无标记转化方法，其特征在于，该方法首先构建低温诱导WCS120启动子驱动的ParA/MRS位点特异性重组系统植物表达载体；通过农杆菌转化法转化小麦，筛选获得转基因植株；然后进行转基因后代标记基因删除检测和抗旱性检测，建立小麦无选择标记基因转化体系，获得无选择标记基因转化植株。

【技术特征摘要】
1.一种低温诱导位点特异性重组删除的无标记转化方法，其特征在于，该方法首先构建低温诱导WCS120启动子驱动的ParA/MRS位点特异性重组系统植物表达载体；通过农杆菌转化法转化小麦，筛选获得转基因植株；然后进行转基因后代标记基因删除检测和抗旱性检测，建立小麦无选择标记基因转化体系，获得无选择标记基因转化植株。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，具体的步骤是：步骤1)：低温诱导删除中间载体pXL5523-fwcs的构建用核酸内切酶AatⅡ和AscⅠ双酶切pXL5523载体，去掉花粉特异性启动子Lat52，回收载体大片段，用AatⅡ和AscⅠ双酶切T3-fwcs载体，回收fwcs启动子；然后用T4DNA连接酶将fwcs启动子连接到切除Lat52启动子的pXL5523质粒上，转化后以wcsr1/wcsf1为引物进行菌落PCR检测；扩增体系：2.5μL的10×PCRbuffer+Mg2+、2.0μL的dNTP、wcsr1/wcsf1引物各1.0μL、模板菌液1.0μl、pfu聚合酶0.2μL，用ddH2O补足至25μL；反应程序：95℃，4min；94℃，45s；58℃，45s；72℃，2min；32个循环；72℃再延伸10min；阳性菌落提质粒后用AscⅠ和AatⅡ进行双酶切鉴定，正确的阳性克隆送测序鉴定，序列正确的命名为pXL5523-fwcs；步骤2)：位点特异性重组植物表达载体pXL5523-fwcs-RDA的构建以载体pRd29A::PYL5为模板，用含有ApaⅠ酶切位点的引物RDn-F3/RDn-R3扩增1.9kb的RD29A-PYL5-nosT表达框；PCR反应体系：10×PCRbuffer+Mg2+：2.5μL，dNTP：2.0μL，RDn-F3/RDn-R3引物：各1.0μL，模板DNA：1.0μL，pfu聚合酶：0.2μL，用ddH2O补足至25μL；PCR反应程序：95℃：4min；94℃：45s，65℃；45s，72℃：4min，32个循环；72℃再延伸10min；PCR产物回收加尾后连接pEASY-T1载体，重组载体转化大肠杆菌后以RDn-F3/RDn-R3为引物进行菌落PCR鉴定，重组质粒用ApaⅠ进行酶切检测和测序验证，测序正确的命名为T1-RDA；酶切回收重组质粒T1-RDA中的RD29A-PYL5-nosT表达框，与经ApaⅠ酶切并去磷酸化的载体pXL5523-fwcs连接，转化后用RDn-F3/RDn-R3进行扩增检测，检测呈阳性的菌落提质粒进行ApaⅠ单酶切鉴定，酶切得到1.9kb的目的基因片段及载体骨架，正确的克隆送测序，测序正确即命名为pXL5523-fwcs-RDA；步骤3)植物表达载体pXL5523-fwcs-RDA小麦转化及检测(1)愈伤组织准备小麦成熟种子用浓度为75％的酒精消毒3min～5min，蒸馏水冲洗3～5次，再用浓度为0.1％的升汞消毒10min，之后再用蒸馏水彻底清洗3次，种子经表面消毒后在无菌水中26℃、黑暗条件下浸泡16～20h，然后在无菌条件下剥出种胚，接种在诱导培养基上，25±1℃暗培养15d；(2)农杆菌转化及筛选A：挑取pXL5523-fwcs-RDA重组表达载体转化的的阳性农杆菌GV3101单菌落于2ml含有三种抗生素的YEB培养液中28℃，200rpm振荡培养24～48h；B：按照1％的接种量将培养液接种至添加三种抗生素及0.2mmol/L的乙酰丁香酮(AS)的YEB液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养至菌液OD600值为0.6～0.8；C：将培养好的菌液转...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘香利，王梅，赵惠贤，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61