一种促进细胞分泌外泌体的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种促进细胞分泌外泌体的方法及应用，涉及生物材料、组织工程和再生医学领域，本发明专利技术采用的方法是使用生物材料活性信号刺激细胞，收集其产生的外泌体，并将其用于组织创伤治疗。本发明专利技术还详细介绍了该方法的操作路线以及所得到外泌体的应用方案，在生物活性玻璃化学信号、静电纺丝纤维膜结构信号及化学/结构组合信号刺激作用下，间充质干细胞和脐静脉内皮细胞均能分泌更多外泌体颗粒，且这些外泌体均能促进其对应的靶细胞表达更高水平的功能基因、分泌更多功能蛋白、进行更深度地功能分化，从而促进组织创面快速修复。本发明专利技术公开的方法获得的细胞外泌体具有产量更高、促进组织修复功能更强的特点。

A Method for Promoting Cell Secretion of Exosomes and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种促进细胞分泌外泌体的方法及应用
本专利技术涉及生物材料、组织工程和再生医学领域，尤其涉及一种促进细胞分泌外泌体的方法及应用。
技术介绍
组织创伤在临床上一直面临着庞大的病患队伍，虽然人体组织具有一定的自我修复能力，但是当创伤面积过大、患者身体虚弱、机体功能差或创面局部环境紊乱不利于其自身修复，例如血管被严重破坏、血液及营养供给不足时，创伤便无法正常修复，而长时间未正常修复的创面不仅严重影响病患的生活质量，甚至还会引起身体的其他病变，进一步危害患者健康。因此，寻找一种能够促进组织创伤快速、有效修复的方法一直是临床研究的热点方向。生物材料已被广泛应用于组织工程和再生医学，而生物材料作用于组织细胞则最主要以其自身携带的活性信号进行刺激。已有广泛研究显示，生物材料，如生物活性硅酸盐陶瓷、静电纺丝纤维膜、水凝胶等，能够明显促进皮肤创伤、骨缺损和骨-软骨组织等的修复。然而，直接应用生物材料于组织创伤部位进行治疗则面临着免疫排斥、材料毒性、材料降解和浓度难把握等困难。细胞，尤其是干细胞，在正常组织的新陈代谢及受损组织的自我修复过程中发挥的作用越来越被重视，利用细胞移植进行促进组织创伤修复已成为再生医学领域一种重要的手段。从大量的临床研究结果来看，在组织创面进行细胞移植能够明显促进受损组织再生和功能恢复，而进一步的研究发现，移植的细胞主要通过分泌各种分子、生长因子、细胞因子、蛋白、细胞外微囊泡等成分并作用于其他参与组织修复的细胞，继而激活这些参与组织修复的细胞使其快速表达相关功能蛋白，进行细胞-细胞间旁分泌交流机制，最终实现促进组织创伤快速修复。然而，近些年的研究发现，细胞治疗存在着诸多缺点，如细胞来源有限、细胞移植密度难以把握、移植细胞引起组织创面组织过度增生甚至形成肿瘤、免疫排斥反应等。外泌体是细胞分泌的具有多种生物功能的纳米囊泡，是重要的细胞分泌物和细胞-细胞间进行旁分泌交流的信号载体。外泌体中装载有多种蛋白、磷酯类、供体细胞全部基因组、mRNA、microRNA等，可通过胞吞胞饮、受体结合、配体介导等多种方式被受体细胞捕获内化，并对受体细胞产生一定的生物学效应，从而实现细胞-细胞间的旁分泌交流。在初期的研究中，研究者发现病变组织或细胞分泌的外泌体在成分上与正常组织分泌的外泌体明显不同，因此外泌体也一度被作为临床疾病诊断的重要指标，而且外泌体诊断具有超微创甚至完全无创的优势。而最近几年的研究发现，所有细胞都能分泌外泌体，而同一种细胞在不同条件下分泌的外泌体，其携带的生物信息和具备的生物功能也明显不同。在组织工程和再生医学领域的研究中，众多结果显示，用外泌体进行组织创伤治疗具有与细胞移植治疗同水平的促进组织修复功能，而且避免了细胞移植治疗的诸多缺陷，如免疫排斥等。但是细胞在常规培养条件下分泌外泌体的能力有限，且其功能往往单一。因此，本领域的技术人员致力于开发一种能够促进细胞分泌数量更多且具有更强促进组织修复功能的外泌体的方法。
技术实现思路
有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是如何提供一种促进细胞分泌数量更多且具有更强促进组织修复功能的外泌体的方法为实现上述目的，本专利技术提供了一种促进细胞分泌外泌体的方法，所述方法采用生物材料活性信号对细胞进行刺激。进一步地，所述生物材料活性信号为生物材料活性化学信号、生物材料活性结构信号和生物材料活性力学信号中的任意一种或多种。进一步地，所述外泌体由具有组织修复功能的干细胞、成体细胞及免疫细胞分泌而得。进一步地，所述方法包括以下步骤：步骤1、将生物活性玻璃加入无血清间充质干细胞培养液中培养，无菌过滤收集滤液即得到生物活性玻璃浸提液；步骤2、利用高速旋转滚筒收集聚己内酯/外消旋聚乳酸(PCL/PDLLA)电纺丝得到定向静电纺丝纤维膜；步骤3、用所述无血清间充质干细胞培养液按1:128比例稀释所述生物活性玻璃浸提液，并继续培养间充质干细胞一段时间，收集培养上清液；步骤4、将步骤2所述定向静电纺丝纤维膜裁剪成适宜大小，灭菌处理后置于培养皿，加入间充质干细胞悬浮液，用完全间充质干细胞培养液培养1天，弃掉旧培养液，加入所述无血清间充质干细胞培养液继续培养所述间充质干细胞一段时间，收集培养上清液；步骤5、将所述定向静电纺丝纤维膜裁剪成适宜大小，灭菌处理后置于，加入所述间充质干细胞悬浮液，用所述完全间充质干细胞培养液培养1天，弃掉旧培养液，用所述无血清间充质干细胞培养液按照1:128比例稀释步骤1中所述生物活性玻璃浸提液，并继续培养所述间充质干细胞一段时间，收集培养上清液；步骤6、采用超速-梯度离心法提取步骤3、4、5中收集到的所述培养上清液中的所述外泌体，即得到所述间充质干细胞分别经所述生物材料活性化学信号、所述生物材料活性结构信号和生物材料活性化学/结构组合信号刺激产生的所述外泌体。进一步地，所述生物活性玻璃浸提液稀释后的Ca离子浓度为65.05±0.35μg/mL，Si离子浓度为1.01±0.07μg/mL。进一步地，所述高速旋转滚筒的转速为2000r/min。进一步地，每平方厘米所述定向静电纺丝纤维膜上加入的所述间充质干细胞的数量为1×104～3×104。进一步地，所述聚己内酯/外消旋聚乳酸(PCL/PDLLA)电纺丝通过将质量比为1:1的PCL和PDLLA以4.8％的质量体积比溶解于体积比为4:1的DMF和THF中，利用静电纺丝设备以10kv电压、0.02mL/min流量和12cm接收距离的条件下制备而得。进一步地，所述定向静电纺丝纤维膜裁剪后还需紫外照射灭菌和酒精浸泡。本专利技术还提供上述的促进细胞分泌外泌体的方法在制备促进创伤修复外泌体材料中的应用。本专利技术中细胞培养环境、培养器皿及培养技术相比于常规细胞培养皆无额外要求，通过在细胞培养过程中加入生物材料活性信号刺激细胞使其快速分泌释放外泌体，这些外泌体具有产量高、促进组织修复功能强的特点，能够促进外泌体对应受体细胞快速表达其功能基因并合成相应蛋白，如间充质干细胞来源的外泌体，可促进其受体细胞脐静脉内皮细胞快速表达血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体(KDR)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)等成血管相关的生长因子和蛋白；而脐静脉内皮细胞来源的外泌体，可促进其受体细胞骨髓间充质干细胞快速表达碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)、胶原蛋白-1(COL-I)等成骨相关基因及蛋白，促进受体细胞进行快速功能分化，从而促进创面快速修复。在实际应用中，用该方法得到的间充质干细胞外泌体能够促进脐静脉内皮细胞在体外快速成网状生长，并且在体内小鼠皮下快速生成更多微小血管；用该方法得到的脐静脉内皮细胞外泌体能够促进骨髓间充质干细胞快速成骨分化。以下将结合附图对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。附图说明图1是实施例1的BG化学信号、PCL/PDLLA定向静电纺纤维膜结构信号和组合信号刺激骨髓间充质干细胞产生外泌体颗粒浓度随时间的变化规律图；图2是实施例1的BG化学信号、PCL/PDLLA定向静电纺纤维膜结构信号和组合信号刺激脐静脉内皮细胞产生外泌体颗粒浓度随时间的变化规律图；图3是实施例2的没有外泌体作用脐静脉内皮细胞24h后vWF染色结果图；图4是实施例2的BG化本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种促进细胞分泌外泌体的方法，其特征在于，所述方法采用生物材料活性信号对细胞进行刺激。

【技术特征摘要】
1.一种促进细胞分泌外泌体的方法，其特征在于，所述方法采用生物材料活性信号对细胞进行刺激。2.如权利要求1所述的促进细胞分泌外泌体的方法，其特征在于，所述生物材料活性信号为生物材料活性化学信号、生物材料活性结构信号和生物材料活性力学信号中的任意一种或多种。3.如权利要求1所述的促进细胞分泌外泌体的方法，其特征在于，所述外泌体由具有组织修复功能的干细胞、成体细胞及免疫细胞分泌而得。4.权利要求1所述的促进细胞分泌外泌体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1、将生物活性玻璃加入无血清间充质干细胞培养液中培养，无菌过滤收集滤液即得到生物活性玻璃浸提液；步骤2、利用高速旋转滚筒收集聚己内酯/外消旋聚乳酸(PCL/PDLLA)电纺丝得到定向静电纺丝纤维膜；步骤3、用所述无血清间充质干细胞培养液按1:128比例稀释所述生物活性玻璃浸提液，并继续培养间充质干细胞一段时间，收集培养上清液；步骤4、将步骤2所述定向静电纺丝纤维膜裁剪成适宜大小，灭菌处理后置于培养皿，加入间充质干细胞悬浮液，用完全间充质干细胞培养液培养1天，弃掉旧培养液，加入所述无血清间充质干细胞培养液继续培养所述间充质干细胞一段时间，收集培养上清液；步骤5、将所述定向静电纺丝纤维膜裁剪成适宜大小，灭菌处理后置于，加入所述间充质干细胞悬浮液，用所述完全间充质干细胞培养液培养1天，弃掉旧培养液，用所述无血清间充质干细胞培养液按照1:128比例稀释步骤1中所述生物活...

【专利技术属性】
技术研发人员：李海燕，吴治，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31