一种模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗及其应用制造技术

本发明专利技术属于疫苗领域，涉及一种仿生的纳米疫苗制剂，具体涉及一种模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙‑脂质纳米疫苗及其应用。所述疫苗内层的磷酸钙是高效包载寡聚核苷酸类物质的疏水性纳米颗粒；外层脂质结构是高度模拟细胞膜流动性的材料，能负载天然的细胞膜蛋白和HSP70活性肽段。本纳米疫苗制剂能克服传统肿瘤疫苗的诸多局限，其核心优势在于高度的整合能力，将3种活性成分天然的多价肿瘤细胞膜抗原蛋白(CM)，α螺旋修饰的热休克蛋白HSP70活性肽段(αHSP70p)，佐剂寡聚核苷酸(CpG)包载入磷酸钙纳米粒(CaP)，同时递送至抗原提呈细胞，从而激活固有免疫与适应性免疫。具有较高潜在应用价值与临床转化前景。

A Calcium Phosphate-Lipid Nanovaccine Imitating Necrotic Tumor Cells and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗及其应用
本专利技术属于疫苗领域，涉及一种仿生的纳米疫苗制剂，具体涉及一种具有核壳结构的磷酸钙-脂质纳米颗粒，尤其是一种模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗及其应用。所述疫苗内层的磷酸钙是能够高效包载寡聚核苷酸类物质的疏水性纳米颗粒；外层的脂质结构是高度模拟细胞膜流动性的材料，能够负载天然的细胞膜蛋白和HSP70活性肽段。
技术介绍
资料显示，恶性肿瘤是威胁人类健康的头号杀手，常规的治疗手段包括手术治疗、放射治疗、化学治疗，但实践显示所属的治疗方案均效果有限，其根本原因在于无法抑制肿瘤在体内的转移和复发，同时在治疗过程中具有多种毒副作用。有研究报道了免疫治疗作为一种新型的抗肿瘤治疗方式，能够刺激机体自身的免疫系统实现对肿瘤细胞的有效清除，为恶性肿瘤的治疗带来了新的希望。2011年以来，肿瘤的免疫治疗经过了一个快速发展的阶段，2013年Science杂志也将肿瘤的免疫疗法列为科技十大突破，免疫检查点抑制剂PD/PDL-1抗体针对恶性黑色素瘤的效果亦取得了令人瞩目的效果，显著提高了患者的生存时间；然而，免疫检查点抑制剂疗法面临了治疗响应率低的问题，其中很大部分原因是肿瘤微环境中肿瘤突变负荷不足导致的免疫细胞的浸润偏少，因此，借助于其他方式来构建新的综合治疗手段对于提高检查点阻断治疗的临床效果显得尤为重要。肿瘤疫苗是目前检查点阻断治疗的协同治疗的首选方案。肿瘤疫苗通过直接刺激树突状免疫细胞，能够潜在地活化外周的CD4+/CD8+的T细胞等在肿瘤部位的浸润，从而在上游激活潜在的人体的免疫功能。理想状态下，疫苗激起的CD8+T细胞具有很好的活性，能够识别肿瘤细胞上的多肽-MHCⅠ类抗原肽复合物，针对肿瘤细胞的特异性标志物有更好的识别。但其设计是非常挑战的工作，包括三方面需要考虑的因素：(1)选择合适的肿瘤相关抗原，旨在引起特异性T细胞的应答；(2)选择一种合适的免疫刺激佐剂，旨在激活模式识别受体来增强固有免疫；(3)同时将抗原与佐剂高效递送进入同一个树突状细胞中。实践显示，单一抗原成分的肿瘤疫苗最容易实现临床转化，已有许多正在进行的临床试验，但因为肿瘤的高度异质性和免疫抵抗的影响，尚未实现突破；近年来研制的个性化肿瘤疫苗更多的关注肿瘤异质性和抗原的差异性，取得了一些良好的效果，例如Ott,P.A.等通过计算机算法及实验室高通量测序，筛选出了病人自身的20种新生抗原，以此制备的20种多肽及佐剂的混合物激发了病人强有力的免疫反应，初步证明了基于癌症的个性化肿瘤疫苗可行性；但该方法面临一些缺陷，例如制备过程比较繁琐，游离混合物成分入胞效率较低等。虽然肿瘤裂解物体外刺激树突状细胞肿瘤疫苗Provenge已经被批准用于前列腺癌的治疗，但是受限于肿瘤裂解物中复杂的成分以及免疫耐受问题，效果仍旧有待改进，所以肿瘤疫苗的研发是一个亟待解决的问题。近年来研究逐渐揭示了肿瘤细胞的亚细胞成分具有各自的免疫原性，例如细胞核，细胞质以及细胞膜成分等；首先，某些肿瘤中，例如黑色素瘤，细胞膜中含有大量的肿瘤相关的抗原(TumorAssociatedAntigens，TAA)，可以利用其作为一种潜在有效的抗原材料，而来源于患者自身的肿瘤细胞膜可能是精准治疗的理想材料之一，但是天然的肿瘤细胞膜成分不足以有效激活树突状细胞，添加合适的免疫佐剂成分是发挥治疗作用的关键。有研究发现在低剂量的化疗、放疗以及环境的剧烈变化能够介导肿瘤细胞的坏死(necrosis)，从而释放出大量的具有强烈免疫原性的物质——危险信号分子(dangerassociatedmolecularpatterns,DAMP)，例如热休克蛋白、GRP78BiP，以及钙网蛋白等，可以作为新的免疫佐剂材料。热休克蛋白HSP70是一类分子量在70kDa左右的热应激蛋白质，除了具有分子伴侣的功能外，已在多种肿瘤中发现其表达，并且诱导和增强机体抗肿瘤免疫反应；HSP70具有的特殊结构能够与多肽形成复合物，与抗原递呈细胞表面相关受体结合，同时激发固有免疫和特异性免疫；用于粒细胞性白血病治疗的相关临床试验正进行，但从病人体内分离出的天然HSP70多肽复合物技术复杂，提取效率低下，制备难度较高。基于现有技术的现状；本申请的专利技术人拟提供一种“人工模拟的坏死肿瘤细胞”的纳米递药平台，具体涉及一种具有核壳结构的磷酸钙-脂质纳米颗粒，所述纳米递药平台可同时将肿瘤细胞膜蛋白以及HSP70活性肽段递送至树突状细胞内，将潜在地更好地激活人体的固有免疫和适应性免疫。
技术实现思路
本专利技术的目的在于基于现有技术的现状和基础，提供一种具有核壳结构的磷酸钙-脂质纳米颗粒，尤其是一种模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗及其应用。本专利技术提供一种基于仿生学原理设计的“人工模拟的坏死肿瘤细胞”的纳米颗粒(αHSP70p-CM-CaP)，人工脂质材料中负载天然的多价肿瘤抗原蛋白以及HSP70活性肽段(佐剂)，以磷酸钙为材料制备纳米粒作为内核并包载另一种佐剂寡聚核苷酸CpGODN：一方面利用肿瘤细胞膜蛋白中的新生抗原成分，引起抗肿瘤特异性免疫；另一方面利用寡聚核苷酸CpG和αHSP70p两种佐剂成分，激活人体的固有免疫功能，综合发挥抗肿瘤的作用。本专利技术的“人工模拟的坏死肿瘤细胞”(αHSP70p-CM-CaP)纳米颗粒将克服传统肿瘤疫苗面临的诸多局限，其核心优势在于高度的整合能力，将3种活性成分天然的多价肿瘤细胞膜抗原蛋白(CM)，α螺旋修饰的热休克蛋白HSP70活性肽段(αHSP70p)，佐剂寡聚核苷酸(CpG)包载入磷酸钙纳米粒(CaP)，同时递送至抗原提呈细胞，从而激活固有免疫与适应性免疫。具体的，本专利技术提供了一种模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗，所述疫苗内层的磷酸钙是能够高效包载寡聚核苷酸类物质的疏水性纳米颗粒；外层的脂质结构是高度模拟细胞膜流动性的材料，能够负载天然的细胞膜蛋白和HSP70活性肽段；本专利技术中，将天然来源的肿瘤细胞膜蛋白和α螺旋修饰的HSP70活性肽段结合至一种人工构建的流动的脂质膜材料中，内部的磷酸钙纳米颗粒高效包载寡聚核苷酸CpG。本专利技术所采用磷酸钙构建纳米粒内核，包载寡聚核苷酸类药物CpG具有较高的稳定性和包载效率；其制备方法为反相微乳法，该方法用于包载siRNA类，制备的纳米粒均匀分散至油相中，具有一定的缓释效果。本专利技术所采用的佐剂成分非甲基化寡聚脱氧核苷酸(简称CpGODN)，是一类人工合成的具有免疫刺激作用的含非甲基化的CpG寡聚核苷酸的DNA序列；CpGODN通过与Toll样受体-9(TLR9)结合，可直接激活B细胞和树突细胞引起直接的Th1型免疫反应(CpGODN作为疫苗的免疫佐剂获得了普遍的认可，将实现其商业化应用)，将其包载于上述纳米载体中，能够实现一定的缓释作用，还能够与αHSP70p活性肽段实现协同效应，共同被树突状细胞有效摄取。本专利技术所采用的粒子构建方法具体如下：①以反相微乳法制备包载CpGODN的磷酸钙纳米粒核心，反相微乳是由水溶液分散到含有壬基酚聚氧乙烯醚的环己烷油相溶液中制备得到；②体外培养的B16OVA肿瘤细胞经过超速离心获取肿瘤细胞膜，通过合适的去垢剂将细胞膜蛋白溶解分离，然后进一步超速离心获取细胞膜蛋白溶液；③薄膜本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙‑脂质纳米疫苗，其特征在于，为核壳结构的纳米级仿生粒子，其由磷酸钙构建成的纳米内核和人工合成的脂质双分子层外壳通过疏水作用相结合组成，所述的内核的磷酸钙是高效包载寡聚核苷酸类物质的疏水性纳米颗粒，外壳是高度模拟细胞膜流动性的人工脂质材料，负载天然的细胞膜蛋白和HSP70活性肽段。

【技术特征摘要】
1.一种模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗，其特征在于，为核壳结构的纳米级仿生粒子，其由磷酸钙构建成的纳米内核和人工合成的脂质双分子层外壳通过疏水作用相结合组成，所述的内核的磷酸钙是高效包载寡聚核苷酸类物质的疏水性纳米颗粒，外壳是高度模拟细胞膜流动性的人工脂质材料，负载天然的细胞膜蛋白和HSP70活性肽段。2.按权利要求1所述的模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗，其特征在于，所述外壳的人工脂质材料负载天然的多价肿瘤细胞膜抗原蛋白以及α螺旋修饰的HSP70活性肽段(αHSP70p)；所述内核以磷酸钙(CaP)为材料制备纳米粒并包载佐剂寡聚核苷酸CpG；所述的疫苗采用寡聚核苷酸CpG和HSP70p作为佐剂成分。3.按权利要求1所述的模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗，其特征在于，所述的磷酸钙内核所采用的佐剂成分非甲基化寡聚脱氧核苷酸(简称CpGODN)是人工合成的具有免疫刺激作用的含非甲基化的CpG寡聚核苷酸的DNA序列，所述CpGODN序列为CpGODN1826(5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’)。4.按权利要求1所述的模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗，其特征在于，所述的外壳的脂质中添加佐剂成分为α螺旋修饰的HSP70活性肽段(αHSP70p)。5.按权利要求1所述的模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗，其特征在于，所述的细胞膜蛋白为多价肿瘤细胞膜蛋白成分，其选自小鼠来源的B16OVA细胞，为通过体外扩增和提取获得的基因工程改造的稳定表达OVA模型抗原的小鼠黑色素瘤细胞系。6.按权利要求1所述的模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗，其特征在于，所述的人工脂质膜材料是胆碱磷酸结构的脂质和胆固醇，包括DPPC...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈钧，康婷，黄宇坤，朱倩倩，陈雨，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31