一种制备小菜蛾雄性不育品系的方法及其核酸技术

本发明专利技术公开了制备小菜蛾雄性不育品系的方法及其核酸。本方法包括以下步骤：1)合成sgRNA，所述的sgRNA的模板从5’端到3’端包括以下可操作性元件：T7启动子，Ser2基因靶点和gRNA；2)合成Cas9mRNA，所述的Cas9mRNA的模板从5’端到3’端包括：启动子，Cas9编码序列和SV40终止子；3)将步骤1)所得的sgRNA和步骤2)所述的Cas9mRNA混合后显微注射小菜蛾新鲜卵中，孵化，即得雄性不育的小菜蛾。本发明专利技术利用CRISPR/Cas9技术敲除小菜蛾Ser2基因，提供了小菜蛾雄性不育遗传品系，解决了传统的通过辐射和四环素诱导不育昆虫的方法不能稳定有效遗传给后代的问题。通过对雌性突变体小菜蛾的释放，可用于野外防治小菜蛾虫害，为害虫防治提供新思路。

A Method for Preparing Male Sterile Lines of Plutella xylostella and Their Nucleic Acids

【技术实现步骤摘要】
一种制备小菜蛾雄性不育品系的方法及其核酸
本专利技术属于生物
，涉及一种制备小菜蛾雄性不育品系的方法及其核酸。
技术介绍
小菜蛾是重要的经济作物害虫。小菜蛾(Plutellaxylostella)属鳞翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae)，全球性分布，严重危害十字花科植物。目前，除了南北极和沙漠等极端气候区未发现小菜蛾外，其余各地都有小菜蛾的踪迹。在全球范围内，每年因小菜蛾危害造成的经济损失和防治费用高达50亿美元(Furlongetal.,2013)。更为严重的是，在小菜蛾防治过程中，其对化学杀虫剂的过度依赖造成了小菜蛾的严重抗药性，这进一步增加了防治难度(Furlongetal.,2013)。因此，发展新的防治方法对控制小菜蛾危害具有积极的意义。昆虫不育技术(SIT)一直是害虫防治的研究及应用的热点，早期美国利用辐射不育技术首次成功地消灭了螺旋锥蝇(Cochliomyiahominivorax)，在日本通过释放通过辐射处理的不育瓜实蝇(Bactroceracucuribitae)使其根绝成功。通过利用四环素调控地中海实蝇(Ceratitiscapitata)雌性的剪接因子，可以使雌性特异性致死。虽然辐射技术和四环素特异性表达都能诱导昆虫不育，但是都不能获得稳定的遗传品系。在昆虫交配生殖过程中，雄性精液蛋白通过射精行为转移到雌体内，该雄性精液蛋白对雄性和雌性的生殖成功是必不可少的。雄性精液蛋白能够影响雄性精子竞争的成功和雌性的生殖力、生育力、寿命及后代存活率等。据研究报道，雄性副性腺蛋白在生殖交配过程中的分泌是可塑的，可在自然选择下快速进化，且比迄今被认为的更复杂。目前，国内对小菜蛾不育技术的研究还是处于空白阶段，没有一种针对小菜蛾雄性不育技术的报道。国外报道了一种通过雄性小菜蛾特异表达四环素后代交配致死的品系。但四环素诱导小菜蛾不育技术存在一定局限性和缺点：首先是不可遗传的，需要定室内构建品系胡期释放小菜蛾，其次每次释放工作量非常大，操作难度高。另外在鳞翅目模式昆虫家蚕中对不育技术的主要是中国农业科学院蚕业研究所研发的雄性不育系——镇江野败，与国外报道的3种类型①雄蛾阴茎肌退化slp②精子缺乏slo③精荚异常sls相比，镇江野败具有高度不育性和生殖系统发育异常多型性特点，是目前理想的不育品系，但家蚕中的镇江野败雄性不育品系是通过野桑蚕与家蚕远缘杂交育种获得，这在小菜蛾中难以操作，目前还没有发现该种害虫在种群间有像家蚕与野桑蚕之间如此大的差异。并且其不育品系的不育机制复杂，表现出多种不用的突变表型，且在遗传学上无法与基因相对应，这在小菜蛾中得到相类似不育品系十分困难。因此，本领域急需获得一种小菜蛾可遗传的不育技术体系，且操作重复性高，未来容易在小菜蛾及其它害虫中易推广的技术方法。
技术实现思路
本专利技术的针对小菜蛾遗传不育技术中缺乏雄性不育品系的不足，提供一种制备雄性不育的小菜蛾的方法及其核酸。为此，本专利技术提供制备雄性不育的小菜蛾的方法，包括以下步骤：1)合成sgRNA，所述的sgRNA的模板从5’端到3’端包括以下可操作性元件：T7启动子，Ser2基因靶点和gRNA；2)合成Cas9mRNA，所述的Cas9mRNA的模板从5’端到3’端包括：启动子，Cas9编码序列和SV40终止子；3)将步骤1)所得的sgRNA和步骤2)所述的Cas9mRNA混合后显微注射小菜蛾新鲜卵中，孵化，即得雄性不育的小菜蛾。优选的，所述的Ser2基因靶点的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。优选的，所述的sgRNA的模板的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。优选的，所述的Cas9mRNA的模板的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。优选的，步骤3)所述的sgRNA和所述的Cas9mRNA是等摩尔量混合。本专利技术还提供一种防治小菜蛾的方法，包括以下步骤：将所述的方法制备而得的雄性不育的雄性小菜蛾野外放生，通过与野生小菜蛾交配，使后代减少，降低种群数量。本专利技术也提供制备雄性不育的小菜蛾的核酸，所述的核酸从5’端到3’端包括以下可操作性元件：T7启动子，Ser2基因靶点和gRNA。优选的，所述的核酸的模板的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术也提供一种制备雄性不育的小菜蛾的核酸混合物，包括所述的核酸和Cas9mRNA。优选的，所述的Cas9mRNA的模板的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术利用CRISPR/Cas9技术敲除小菜蛾Ser2基因，提供了小菜蛾雄性不育遗传品系，解决了传统的通过辐射和四环素诱导不育昆虫的方法不能稳定有效遗传给后代的问题。通过对雌性突变体小菜蛾的释放，可用于野外防治小菜蛾虫害，为害虫防治提供新思路。附图说明图1小菜蛾基因组结构图和敲除突变检测。A：小菜蛾Ser2基因结构及敲除靶点，红色为PAM序列；B：PCR产物检测是否突变。C：敲除后的突变类型。图2小菜蛾Ser2基因突变影响卵孵化。A：野生型雌、雄虫交配产的卵第三天发育；B：野生型雌虫与突变的雄虫交配产卵第三天不发育；C：野生型雄虫与突变的雌虫交配产的卵第三天发育；D：突变的雌、雄虫交配产卵第三天不发育。图3小菜蛾突变后对交配行为无影响。A野生型雌雄虫交配行为拍照；B突变体雌雄虫交配行为拍照。图4突变体成虫交配时间与野生型交配时间对比无显著差异。具体实施方式本专利技术人经过广泛研究和反复试验，通过对基因突变位点的选择以及转基因质粒的构建，敲除小菜蛾Sericin2-encoding(PxSer2)基因，构建了一个Ser2基因突变小菜蛾品系，发现Ser2基因突变后，雌雄突变体的正常交配行为均不受影响，雌性突变体作为亲本的小菜蛾卵孵化率正常，然而雄性突变体作为亲本的小菜蛾卵不能孵化，可见Ser2基因突变体家小菜蛾雄性高度不育，且雌虫突变体可遗传到下一代雄虫，达到稳定遗传的有效突变后代，从而完成了本专利技术。鳞翅目包括蛾、蝶两类昆虫。属于有翅亚纲、全变态类。全世界已知约20万种，中国已知约8000余种。该目为昆虫纲中仅次于鞘翅目的第2个大目。包括麦蛾科；粉蝶科，如麦蛾、棉红铃虫、马铃薯块茎蛾和甘薯麦蛾等；卷蛾科，如棉褐带卷蛾、大豆食心虫等；螟蛾科，如梨大食心虫、玉米螟等；尺蛾科，如大造桥虫等；粉蝶科，如菜粉蝶等；夜蛾科，如粉蚊夜蛾、棉铃虫等；毒蛾科，如舞毒蛾等；凤蝶科，如玉带风蝶、金风蝶等；舟蛾科，如舟形毛虫等；灯蛾科，如黄腹灯蛾、红腹灯蛾、美国白蛾等；天蛾科，如葡萄天蛾等；蚕蛾科，如家蚕等；天蚕蛾科，如樗蚕等；弄蝶科，如稻苞虫等。鳞翅目昆虫的分布范围极广，以热带种类最为丰富。绝大多数种类的幼虫为害各类栽培植物，体形较大者常食尽叶片或钻蛀枝干。体形较小者往往卷叶、缀叶、结鞘、吐丝结网或钻入植物组织取食为害。成虫多以花蜜等作为补充营养，或口器退化不再取食，一般不造成直接危害。综上所述，鳞翅目昆虫大多数是害虫，也有少数，例如家蚕是有经济价值的昆虫。因此，对鳞翅目昆虫的大规模雄性不育技术进行研究，对于害虫的防治以及有经济价值的转基因产物将产生极大的现实意义。因此，在优选的实施方式中，本专利技术的鳞翅目昆虫是小菜蛾。丝氨酸蛋白酶类是精液蛋白中的而重要成分，其中小菜蛾Sericin2-encoding(PxSer2)基因编码的一种丝氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备雄性不育的小菜蛾的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)合成sgRNA，所述的sgRNA的模板从5’端到3’端包括以下可操作性元件：T7启动子，Ser2基因靶点和gRNA；2)合成Cas9 mRNA，所述的Cas9 mRNA的模板从5’端到3’端包括：启动子，Cas9编码序列和SV40终止子；3)将步骤1)所得的sgRNA和步骤2)所述的Cas9 mRNA混合后显微注射小菜蛾新鲜卵中，孵化，即得雄性不育的小菜蛾。

【技术特征摘要】
1.一种制备雄性不育的小菜蛾的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)合成sgRNA，所述的sgRNA的模板从5’端到3’端包括以下可操作性元件：T7启动子，Ser2基因靶点和gRNA；2)合成Cas9mRNA，所述的Cas9mRNA的模板从5’端到3’端包括：启动子，Cas9编码序列和SV40终止子；3)将步骤1)所得的sgRNA和步骤2)所述的Cas9mRNA混合后显微注射小菜蛾新鲜卵中，孵化，即得雄性不育的小菜蛾。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Ser2基因靶点的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的sgRNA的模板的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Cas9mRNA的模板的核苷酸序列如SEQIDNO...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄勇平，陈希恩，王耀辉，牛长缨，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海,31